Poliovirus 식별을위한 입자 응집 방법

다음 절차의 전체적인 목표는 간단한 프로토콜을 사용하여 폴리오 바이러스 분리주를 신속하게 식별하는 것입니다. 본 분석에서는 인간 폴리오바이러스 수용체의 세포 외 도메인과 IgG2 fc가 연결된 키메라 분자로 코팅된 감작 젤라틴 입자를 사용합니다. 이 입자들은 모든 혈청형의 폴리오바이러스 분리주에 대해 균일한 친화력을 가지므로, 인간 폴리오바이러스가 포함된 시료와 함께 배양하면 입자의 응집이 일어납니다.

하지만 샘플에서 분리된 특정 바이러스를 인식할 수 있는 항체가 존재하면 중화 반응이 일어나 응집이 억제되므로, 이 실험 시스템을 사용하여 폴리오바이러스 분리주를 단일 단계 반응으로 신속하게 식별할 수 있습니다. 기존의 중화 시험과 같은 방식과 비교했을 때 이 기술의 주요 장점은 절차와 해석이 매우 간편하여, 필요한 노동력을 줄이고 결과를 도출하는 시간을 단축할 수 있다는 점입니다. anti PV one, PV two 및 PV three 항체를 재구성하려면 각 바이알에 0.5 milliliters의 물을 추가하십시오.

그 다음 각 항체 용액을 4.5 milliliters의 유지 배지가 들어 있는 별도의 튜브로 옮깁니다. 일부 anti PV 항체 로트는 재구성된 형태로 제공되므로, 이러한 anti PV 항체 로트의 경우 재구성을 위한 물 첨가가 필요하지 않습니다.

다음으로, 새로 라벨을 붙인 튜브에 혼합 항체 용액을 일대일 비율로 섞어 최종 부피가 3.6 milliliters가 되도록 준비합니다. 예를 들어, anti PV one 1.8 milliliters와 anti PV two 1.8 milliliters를 혼합합니다. anti PV one 및 PV two 조합을 준비하기 위해, 가능한 모든 쌍의 조합에 대해 이 과정을 반복하고, 또한 각 항혈청을 1.2 milliliters씩 함께 섞어 세 종류의 항체를 모두 포함하는 용액을 준비합니다.

각 항체 용액에 720 µL의 FCS를 첨가하여 네 가지 혼합물을 만듭니다. 이는 분석 중에 항체에 의한 젤라틴 입자의 비특이적 응집을 줄이는 데 도움이 됩니다. 항체 풀은 응집 분석에 사용될 때까지 -20 °C에서 보관할 수 있습니다.

본 분석법에서는 인간 폴리오바이러스 수용체의 세포 외 도메인과 마우스 FC 도메인의 IgG2가 코팅된 동결건조 젤라틴 입자를 사용합니다. 응집 이미지의 일관성을 보장하기 위해 한 실험 내에서 서로 다른 로트의 입자를 섞어 쓰지 말고 단일 로트의 입자만을 사용하십시오. 각 바이알에 1.5 milliliters의 재구성 완충액을 넣어 입자를 재구성합니다. 가볍게 두드려 잘 섞어줍니다.

재구성된 입자는 4 °C에서 최대 2주 동안 보관할 수 있습니다. 먼저, 96웰 마이크로타이터 플레이트(microtiter plate)를 사용하여 실험을 설계하십시오. 각 샘플의 1번 웰에는 바이러스만 넣습니다.

2번부터 5번 웰에는 바이러스와 4가지 혼합 항체 용액 중 하나가 각각 들어갑니다. 바이러스나 항체가 포함되지 않고 배지만 들어있는 음성 대조군을 위해 웰 하나를 반드시 남겨두십시오. 플레이트 설정이 완료되면, 2행부터 5행까지의 각 웰에 해당 항체 용액 12 µL와 성장 배지 12 µL를 첨가합니다.

1행의 웰들에는 바이러스 단독 배지를, 6행의 음성 대조군 웰에는 배지를 추가합니다. 다음으로, 처음 5개 행에는 바이러스 샘플 12 µL를 추가하고 6행의 음성 대조군 웰에는 성장 배지 12 µL를 추가합니다. 항체와 바이러스를 플레이팅한 후, 가볍게 두드려 재구성된 젤라틴 입자를 재현탁하고 즉시 모든 웰에 웰당 25 µL의 입자를 추가합니다.

각 웰에 동일한 양의 입자를 얻기 위해서는 입자를 플레이트로 옮기기 전에 침전되지 않도록 하는 것이 중요합니다. 어세이 플레이트를 플레이트 믹서에 올리고 30초 동안 혼합합니다. 그 다음 플레이트를 흰 종이 위에 올리고 실온에서 2시간 동안 배양하여 응집이 일어나도록 합니다.

형성된 응집물은 불안정하므로 배양 중이나 배양 후에 플레이트를 절대 움직이지 않는 것이 중요합니다. 반응이 일어난 후, 각 웰의 응집 품질을 확인할 수 있도록 플레이트 사진을 여러 장 촬영하십시오. 왼쪽에서 보는 바와 같이 응집이 일어나지 않은 웰에서는 유색 젤라틴 입자가 웰 바닥에 침전되며, 응집이 일어난 웰에서는 그렇지 않습니다.

바이러스와 pvr, IgG two A 코팅 젤라틴 입자 사이의 상호작용으로 인해 중앙에 표시된 것과 같이 확산된 색상 패턴이 나타납니다. 본 실험에서는 항체가 존재하는 상태에서 바이러스 용액 PV one, two, 및 three가 응집을 유도하는 능력을 테스트했습니다. 바이러스나 항체가 없는 여기에 표시된 조합의 경우 응집이 일어나지 않으며 젤라틴 입자가 침전되는 반면, 바이러스는 포함되어 있으나 항체는 없는 웰에서는 대조적인 결과가 나타납니다.

바이러스의 상호작용으로 인해 응집이 발생했습니다. 실험 웰의 PVR IgG 2A 코팅 젤라틴 입자에서는, 해당 바이러스를 특이적으로 중화하는 항체가 포함된 모든 웰에서 바이러스의 응집이 방지됩니다. 예를 들어, poliovirus type one의 응집은 anti PV one 항체가 포함된 웰에서는 방지되지만, anti PV two 및 anti PV three 항체만 포함된 웰에서는 방지되지 않습니다.

폴리오바이러스 2형과 3형의 경우도 마찬가지입니다. 이 기술을 숙달하면 적절하게 수행했을 때 최소 3시간 만에 완료할 수 있습니다.