생물 학적 시스템에서 이온 농도의 측정을위한 형광 Nanoparticles

다음 실험의 전반적인 목표는 in vitro 및 in vivo 응용을 위한 나트륨 나노센서를 제작하는 것입니다. 이는 나노센서의 센서 성분을 포함하는 opto 혼합물을 준비함으로써 달성됩니다. 두 번째 단계로, 계면활성제를 수용액 상에서 초음파 처리하여 균일하게 분산시키며, 이후 opto를 첨가하면 나노센서가 형성됩니다.

다음으로, 용액 상태의 나노센서를 형성하기 위해 초음파 처리 하에 opto 혼합물을 수성 계면활성제 혼합물에 첨가합니다. 이 영상은 센서 반응을 조절할 수 있음을 보여줍니다. 센서는 심근세포 내로 미세 주입될 수 있으며, 마우스의 피하로도 주입 가능합니다.

형광 지시약 염료와 같은 기존 방법과 비교하여 이 기술의 주요 장점은, 센서를 생리적 환경과 일치하는 동적 범위로 조정할 수 있어 더 넓은 범위의 분석물을 측정할 수 있으며 정량적 분석을 위한 비율 측정(ratiometric measurement)을 수행할 수 있다는 점입니다. 일반적으로 이 방법이 처음인 사람들은 센서 제작 후 이를 생물학적 환경에 도입하는 과정에서 어려움을 겪을 수 있습니다. 서면 프로토콜에 따라 optode를 제작하기 전에 건조 sodium ion four x, 건조 sodium TFPB 및 chromo four three의 스톡 용액을 미리 준비해야 합니다.

흄 후드 내에서 모든 재료를 1.5 milliliter 유리 바이알에 넣고 혼합합니다. 테플론 코팅 스크류 캡을 닫고, 모든 PVC가 용해될 때까지 바이알을 가볍게 볼텍싱합니다. 용액은 붉은색으로 보여야 합니다.

4g 유리 바이알에 10 mg/mL PEG 지질 100 µL를 첨가하여 나노센서 제작을 시작합니다. 다음으로, 10 mM HEPES와 같이 원하는 수용액 4 mL를 첨가합니다.

실험용 잭을 사용하여 초음파 처리 팁을 바이알 내부로 7 mm 깊이까지 넣고, 30초 동안 낮은 출력으로 초음파 처리를 수행합니다. 0.6 mL 튜브에 광학 재료 50 µL와 디클로로메탄 50 µL를 피펫으로 취해 넣고 고르게 섞이도록 합니다. 이어서 3분 동안 초음파 처리를 시작합니다.

초음파 처리를 시작함과 동시에, 피펫 팁을 담가 opto 혼합물 100 µL를 한 번에 빠르고 균일하게 주입합니다. pH가 7 이상으로 상승하거나, 용액에서 잔류 THF 및 di chloro methane을 제거할 나트륨이 없는 경우 용액이 파란색으로 변합니다. 초음파 처리 팁을 2 mm 깊이로 이동시킵니다.

남은 3분이 지나면 용액이 불투명해집니다. 초음파 처리(Sonication)가 완료되면, 나노센서 용액을 5 mL 시린지에 흡입합니다. 필터를 장착하고 나노센서 용액을 스크류 캡이 달린 유리 바이알에 분주합니다.

나노센서의 민감도를 측정하기 위해 나트륨 농도가 점진적으로 증가하는 10가지 용액을 제조하는 것으로 시작합니다. 0 M 및 1 M 나트륨 표준 용액을 50 mL 원뿔형 튜브에 혼합합니다. 이제 광학 바닥 96-웰 플레이트의 한 컬럼 내 세 개 웰에 각 나트륨 농도의 용액을 100 µL씩 첨가합니다.

그 다음, 각 웰에 갓 조제한 나노센서 100 µL를 첨가하고 플레이트를 마이크로플레이트 형광 광도계에 넣은 후, 사용하는 발색단에 최적화된 들뜸, 방출 및 컷오프 파장을 입력합니다. 측정 파장의 선택은 응용 분야에 따라 달라집니다. 이러한 파장을 통해 세포 내의 빠른 동역학 측정이나 노이즈 감소가 가능합니다.

알파 값을 구하려면, 570 nm에서의 강도와 670 nm 또는 680 nm에서의 강도 비율을 계산하십시오. 알파 값을 나트륨 농도의 로그 값에 대해 도표로 나타내십시오. 이때 나트륨 농도가 0인 경우의 로그 값은 -1로 설정합니다.

이제 반응 값에 시그모이드 곡선을 맞추고, 해당 곡선으로부터 alpha 값이 0.5가 되는 나트륨 농도를 계산하십시오. 이는 센서가 최적으로 반응하는 나트륨 농도를 나타냅니다. 이 정보를 바탕으로 opto 내의 sodium iono four x sodium TFPB와 chromo iono four three의 비율을 조정하여 최적의 나트륨 농도를 가진 나노센서를 제작하십시오.

예를 들어, 4가지의 10 서로 다른 나트륨 양만 차이가 있는 서로 다른 광학 제형을 나타내는 5가지 나노센서 세트의 히어로 응답 곡선입니다. 세포 내 이미징을 위해, 세포 배지를 Tyro 용액과 같은 투명한 배지로 교체하고 세포를 이미징 챔버로 옮깁니다. 이제 당긴 유리 피펫을 물에 5 mg/mL glucose로 제조한 나노센서 용액으로 다시 채웁니다.

그 다음 피펫을 마이크로 조작기에 장착하고 이를 압력 제어 주입 시스템에 연결합니다. 피펫을 세포 위로 내려 세포질까지 삽입합니다. 때로는 막을 관통시키기 위해 조작기 홀더를 가볍게 두드려야 할 때가 있습니다.

나노센서 용액 수백 picoliters를 주입한 후 피펫을 빠르게 제거합니다. 마취 챔버를 사용하여 isof fluorine으로 CD one 누드 마우스를 마취시킵니다. 마취가 완료되면, 마우스를 소독된 이미징 챔버에 넣습니다.

다음으로, 10 mM PBS에 녹아 있는 적절한 KD 값의 나노센서 10 µL를 멸균된 31 gauge 인슐린 주사기에 채웁니다. 핀셋을 사용하여 모든 공기 방울을 제거하십시오. 피부를 잡은 상태에서 원하는 주사 부위의 마우스 등 쪽 피부를 살짝 집어 올립니다.

베벨(사면)이 위를 향하게 하고 바늘을 피부와 평행하게 하여 주사기를 피부에 삽입합니다. 이제 주사기 플런저를 뒤로 당겨 바늘이 혈관에 삽입되지 않았는지 확인합니다. 역압을 최소화하려면 바늘을 좌우로 부드럽게 움직여 피부 내에 공간을 만듭니다.

그 다음 센서를 주입하고 주사기를 천천히 제거합니다. 주입 부위를 가볍게 압박하고, 주입 부위에서 흘러나온 용액이 있다면 닦아냅니다. 일반적으로 등 부위를 따라 동일한 간격으로 6곳에 주입합니다.

다른 마우스에게 수행하는 경우, 질병 전파 및 교차 오염을 최소화하기 위해 바늘을 교체하십시오. 주사 후, 나노센서의 들뜸 및 방출 스펙트럼과 밀접하게 일치하는 필터 세트를 사용하여 명시야 및 형광 이미지를 획득하십시오. 이는 피부의 자가형광을 최소화하는 역할도 합니다.

이 신생아 심근세포들은 커버 글라스 위에서 배양되었으며 나트륨 나노센서가 주입되었습니다. 이 형광 이미지는 639 nanometer 흥분 파장에서 촬영되었습니다. 이것은 동일한 세포의 명시야 이미지이며, 마지막으로 두 이미지를 겹쳐 놓은 오버레이 이미지입니다.

일부 센서 응집이 발생하였으나, 세포의 형태는 정상적입니다. 센서가 세포질 전체로 확산되었으며 핵으로의 유입은 관찰되지 않았습니다. 이 명시야 및 형광 이미지 중첩 사진은 누드 마우스의 피하 공간에 나트륨 나노센서를 9군데 서로 다른 위치에 피하 주사한 모습을 보여줍니다.

나노센서 제작법을 익히면 적절한 절차를 통해 수분 내에 완료할 수 있으며, 이를 모든 연구에 적용하여 가역적인 실시간 분석물 변동을 측정할 수 있습니다. 본 영상을 시청하신 후에는 생물학적 환경 내에서 정량적 측정을 위해 나노센서를 세포 내 공간 또는 피하 공간에 로딩하는 방법에 대해 충분히 이해하시게 될 것입니다.