활성 세포 배양을위한 형상 기억 폴리머

이 절차의 전반적인 목적은 시간이 지남에 따라 지형이 변화하는 기질에서 세포를 배양하는 것입니다. 이는 먼저 형상기억고분자를 기억 가능한 영구 형상으로 프로그래밍함으로써 달성됩니다. 그 다음, 형상기억고분자를 일시적 형상으로 프로그래밍하고, 이후 그 위에 세포를 도말합니다.

절차의 마지막 단계는 온도를 높여 형상 기억 고분자가 영구적인 형상으로 돌아가도록 유도하는 것이며, 최종적으로 형광 현미경을 통해 세포 행동의 변화를 보여주는 결과를 얻을 수 있습니다. 안녕하세요, 저는 시러큐스 대학교의 생명 의학 및 화학 공학 교수이자 시러큐스 생체 재료 연구소(Syracuse Biomaterials Institute)의 소장인 Pat Mather입니다.

세포 신장(stretching)을 위한 상용 또는 맞춤형 장치와 비교했을 때 이 기술의 주요 장점은, 단일 고분자 시스템 내에서 세포에 매우 다양하고 복잡한 변형(strain)을 가할 수 있다는 점입니다. 제 이름은 Jay Henderson이며, 생명 의공학 및 화학 공학 조교수이자 Syracuse Biomaterials Institute의 회원입니다.

이 방법은 세포가 물리적 환경의 역동적인 변화에 어떻게 반응하는지와 같은 메카노바이올로지(Mechanobiology) 분야의 핵심 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 저는 시러큐스 대학교 의생명공학 및 화학공학과의 박사 과정 학생인 Kevin Davis입니다. 이 방법은 2D 기계적 생물학에 대한 통찰을 제공할 수 있을 뿐만 아니라, 조직 공학을 위한 3D 형상 가변 스캐폴드와 같은 다른 시스템에도 적용될 수 있습니다.

본 절차를 시작하기 전, 유리 슬라이드, 1mm 두께의 테플론 스페이서 및 알루미늄 플레이트를 사용하여 맞춤형 경화 챔버를 준비하십시오. 작은 바인더 클립을 사용하여 챔버를 고정한 후, 18게이지 바늘을 이용해 테플론 스페이서의 구멍을 통해 NOA 63을 챔버 내로 주입하십시오. 그런 다음, 125°C로 설정된 핫플레이트에 챔버를 놓으십시오.

챔버 가열 후 5분 동안 챔버가 균일한 온도에 도달하도록 둡니다. UV 램프를 유리에 6.5 centimeters 거리로 배치하여 20분 동안 NOA 63을 경화시킵니다. 면도날을 사용하여 NOA 63이 아직 따뜻한 상태일 때 챔버에서 제거합니다.

그런 다음, 125°C의 핫플레이트 위에서 형상 기억 폴리머를 UV 광원 아래에 두고 3시간 40분 동안 후경화시킵니다. NOA 63의 형상 기억 특성을 분석하기 위해, 맞춤형 펀치로 경화된 필름을 열 압착하여 덤벨 모양의 시편을 준비합니다. 마지막으로, 인장 고정 장치가 장착된 동적 기계 분석기(DMA)에 시편을 장착합니다.

기기를 힘 제어 모드로 설정하고, 이 비디오와 함께 제공되는 서면 프로토콜에 명시된 테스트 절차를 프로그램합니다. 이 절차의 결과물은 등온 경화된 형상 기억 폴리머 또는 SMP 필름입니다. 모듈러스를 낮추어 절단을 용이하게 하기 위해 CSMP를 핫플레이트에 놓고 유리 전이 온도보다 높게 온도를 설정합니다. 등온 경화된 SMP 필름으로부터 개별 샘플을 준비합니다.

면도기를 사용하여 s 및 p 필름을 원하는 샘플 크기로 자릅니다. 임시 형상은 여러 가지 다른 방법으로 고정할 수 있습니다. 여기서는 가열 및 냉각이 가능한 플레이트가 장착된 벤치탑 유압 프레스를 사용하여 임시 지형을 엠보싱합니다.

먼저, PLA의 온도를 tg 이상의 온도로 설정합니다. 본 시연에서는 비닐 레코드 위에 에폭시를 경화시켜 평행한 홈 형태의 임시 모양을 가진 엠보서를 제작하였습니다. 엠보서는 다른 재료와 다른 지형으로 제작할 수 있으나, NOA 63보다 강성이 더 높아야 합니다.

엠보싱 온도에서 s 및 p 샘플을 엠보서 위에 엎어 놓습니다. 그다음 샘플과 엠보서를 프레스에 넣습니다. 가열 PLA와 샘플이 접촉하도록 약 100 kilo pascals의 예압을 가하고, 샘플이 균일한 온도에 도달할 수 있도록 약 5분 동안 유지합니다.

균일한 온도에 도달하면 샘플에 1~6 MPa의 압력을 가하고 1분 동안 유지하십시오. 그러면 SMP가 파단됩니다. 더 큰 응력이 가해지면.

더 작은 진폭의 토포그래피를 도입하려면 더 낮은 응력을 가합니다. 압력을 가한 후, 프레스 플레이트의 수냉 기능을 사용하여 온도를 TG 이하로 낮춥니다. 온도가 tg 미만이 되면, 활성 세포 배양 실험을 시작하기 전에 가해진 힘을 제거합니다.

생물 안전 작업대의 UV 램프를 사용하여 시료를 멸균합니다. 뚜껑이 없는 멸균 접시에 시료를 뒤집어서 배치하고, UV 램프를 6시간 동안 켭니다. 그 후 시료를 새로운 멸균 접시로 옮겨 정방향으로 뒤집어 놓습니다.

UV 램프를 6시간 더 켭니다. 세포를 도말하기 전에 샘플을 비교적 안정적인 상태로 평형화해야 합니다. 샘플을 96웰 플레이트에 넣고 150 µL의 완전 성장 배지를 추가합니다.

웰당 배지. 원하는 부분 회복 상태에 도달할 때까지 플레이트를 5% CO2가 포함된 30 °C 인큐베이터에 넣습니다. 본 시연에서는 세포를 정렬하기에 충분한 진폭을 생성하기 위해 샘플을 30시간 동안 배양합니다.

부분적인 회복이 이루어지면, 샘플에 세포를 도말할 수 있습니다. 샘플을 새로운 96-well 플레이트에 옮깁니다. 그런 다음 각 샘플에 150 µL의 세포 용액을 첨가합니다. C3 H 10 t 및 절반.

대부분의 배아 섬유아세포는 mL당 20,000개의 세포 농도로 사용됩니다. 세포를 분리하기 위해, 30 °C에서 9.5시간 동안 배양하여 세포가 일시적 지형 위에 부착되고 퍼지도록 합니다. 그다음, 샘플을 회수하여 염색 및 형광 이미징을 수행함으로써 전이 전 세포 형태를 분석합니다.

이 재료는 UV 및 가시광선 영역의 대부분의 형광 표지자에서 자가형광을 나타내므로, 배경 신호를 줄이기 위해 스펙트럼의 원적색단에 위치한 Alexa Fluor 647과 같은 형광 표지자를 사용하는 것이 권장됩니다. 트리거된 샘플을 회복시키려면 플레이트를 37 °C 인큐베이터로 옮겨 19시간 동안 배양을 계속하십시오. 이렇게 하면 재료가 회복되고 세포가 새로운 지형에 맞춰 형태를 적응시킬 수 있습니다. 배양 후, 필라멘트형 액틴 이미징을 위한 phalloidin과 같은 적절한 염색제를 처리하십시오.

마지막 단계로, 세포를 이미징할 수 있습니다. 여기 제시된 새로운 지형은 단일 NOA 63 경화물의 벌크 일방향 형상 기억 특성을 보여줍니다. 총 3회 반복되었으며, 별표는 실험적 개시 경화 지점을 나타냅니다. NOA 63은 우수한 형상 기억 특성을 가진 투명한 유리질 고체입니다.

이 사례에서 재료는 경화되었으며, 저장 탄성률(storage modulus)의 감소가 시작되는 시점에서 결정된 51.1 °C의 균일한 TG를 나타냅니다. 여기서 관찰되는 변형률(strain)의 감소는 측정된 tg에서 발생합니다. 4.7%의 인가된 변형률 중 상당 부분이 20 °C에서 하중을 제거한 후 고정되었으며, 이는 89.3%의 고정률에 해당합니다. 이후 가열 과정 중 상대적으로 좁은 온도 범위에서 고정된 변형률이 84.4%의 비율로 회복되었습니다.

모든 곡선이 거의 정확히 동일한 경로를 따르는 것으로 나타나, 형상 기억 성능은 3회 사이클까지 저하되지 않았습니다. 임시 지형의 진폭은 30 °C에서 30시간 동안 시간이 경과함에 따라 감소합니다. 30 °C에서.

진폭은 시간 0에서 여기에 표시된 바와 같이 약 50% 감소했습니다. 이후 9.5시간 동안 추가로 10% 더 감소합니다. 온도를 37 °C로 높여 회복을 유도하면, 사용된 엠보서와 4.9 MPa의 엠보싱 응력 조건에서 진폭은 9.5시간 이내에 초기 진폭의 0.5%까지 감소합니다.

이는 13 µm 홈이 있는 표면에서 거의 평평한 표면으로의 기능적 변화에 해당합니다. 이 폴리머는 세포 배양 조건하의 30~37 °C 온도 범위에서 회복됩니다. 이는 배양 배지로부터의 수분 흡수로 인한 것이며, 흡수된 물이 폴리머를 가소화하여 tg를 낮춤으로써 건조 상태의 TG인 51 °C보다 낮은 온도에서도 회복이 가능하게 합니다.

능동형 세포 배양 기판을 사용하여 조절되는 세포 거동의 예로, 일시적 홈 기판 위에서의 세포골격 조직 변화를 들 수 있습니다. 회복이 유도되기 전에는 액틴 미세섬유가 홈의 방향을 따라 정렬됩니다. 온도를 높여 회복시킨 후에는 미세섬유가 재구성되어 무작위로 방향을 잡게 됩니다.

반대로, 정적인 평면 또는 정적인 홈을 가진 대조군 샘플은 온도 상승 후에도 재구성되지 않습니다. 이 절차를 수행할 때, 경화 챔버의 기하학적 구조, 폴리머의 전이 온도, 변형 고정 방법 및 폴리머 자체의 조성을 모두 조정하여 본 절차를 따르는 귀하의 실험에서 원하는 전이를 달성할 수 있다는 점을 기억하는 것이 중요합니다. 기질로부터의 기계적 자극에 반응하여 유전자 발현이 어떻게 변화하는지와 같은 추가적인 질문에 답하기 위해 실시간 PCR과 같은 다른 방법을 사용할 수 있습니다.

이 기술은 세포 역학 생물학 분야의 연구자들이 2차원에서 세포 세포골격, 재배열 및 연성 물질 물리학을 연구할 수 있는 길을 열어주었습니다. 저희 연구에 관심을 가져주시고 시청해주셔서 감사합니다.