Organotypic 문화에의 연결을 눈사태의 다중 전극 어레이 레코딩

본 실험의 목적은 대뇌 피질의 임계 상태 역동성의 특징인 뉴런 아발란체(neuronal avalanches)로 건강한 뇌 활동이 자기 조직화되는 과정을 연구하는 것입니다. 이는 관상면 층상 피질 슬라이스와 피질에 발달상 중요한 도파민성 입력을 제공하는 중뇌 슬라이스를 결합함으로써 이루어집니다. 두 번째 단계로, 피질-중뇌 공배양물을 다전극 어레이(multi electrode array)에서 배양하여 배양 내 뉴런 활동의 다지점 자극 및 기록이 가능하도록 합니다.

다음으로, 일반 공기와 배양액에 교대로 노출되도록 설계된 맞춤형 인큐베이터에서 처음 1~2주 동안 공동 배양물이 평평하게 펴지고 확장되어 MEA 표면에 부착되도록 합니다. 시공간적 국소 전위 폭발(local field potential bursts)이 뉴런 아발란체(neuronal avalanches)로 자발적으로 자기 조직화됨을 보여주는 유체 결과가 도출됩니다. 이는 MEA 기록과 아발란체 크기의 멱법칙(power law)을 식별하는 오프라인 아발란체 분석을 기반으로 합니다.

해리된 배양법과 같은 기존 방법들에 비해 이 기술이 갖는 주요 장점은 시스템 신경과학적 측면입니다. 여러 뇌 영역을 함께 공동 배양할 수 있으며, 이러한 다영역 배양물은 피질층 및 투사 시스템과 같이 거시적 규모에서 정확한 뇌 조직 구조를 형성합니다. 이 기술의 응용 범위는 단순히 뉴런 아발란체(neuronal avalanches) 연구에만 국한되지 않습니다.

예를 들어, 정밀하게 제어된 in vitro 조건 하에서 네트워크 수준의 자극 반응을 연구할 수 있습니다. 혈장 트롬빈 혼합물의 적절한 도포와 MEA 상의 조직 배치는 익히기 어렵기 때문에, 이 방법에 대한 시각적 시연이 매우 중요합니다. 이러한 단계들은 정확한 타이밍과 적절한 온도 구배가 필요하며, 섬세한 MEA 표면을 직접 접촉하지 않도록 주의해야 합니다.

기록을 위한 멸균 가능한 밀폐형 유리 챔버를 준비하려면, 먼저 테플론 플라스틱 캡이 달린 나사산 유리 실린더를 나사산 바닥에서 약 2mm 떨어진 지점에서 절단합니다. 이는 배양 챔버를 안전하고 단단하게 폐쇄하기 위해 필요합니다. 그 다음, 유리 링을 물로 세 번 헹구어 세척한 후, 200 proof 에틸 알코올에서 5분 동안 끓여 소독합니다.

이를 따로 두어 건조시키십시오. 유리 링을 MEA 표면에 부착하려면 실리콘 용액이 필요합니다. Cell Guard 180 4 실리콘 엘라스토머 키트를 사용하여 파트 A와 B를 각각 15 milliliters씩 넣고 충분히 혼합하십시오. 그 후 기포를 제거하기 위해 15분 동안 그대로 둡니다.

용액을 1 mL씩 Eloqua 튜브에 나누어 담고, 향후 사용을 위해 -20 °C에서 보관하십시오. 이제 23 °C의 실리콘 1 mL를 소구경 바늘이 달린 주사기에 취해 유리 링의 연마되지 않은 절단면에 도포하여 MEA에 유리 링을 접착합니다. 그런 다음 유리 링을 MEA의 중앙에 맞추고, 밀폐력을 높이기 위해 링 외곽에 실리콘을 한 층 더 도포하십시오.

핫플레이트 위에서 약 60 °C로 1~2시간 동안 경화시킵니다. 다음으로, 층류 정화 작업대(lamina flow hood) 아래에서 MEA 챔버와 챔버 캡을 탈이온수로 3회 헹구고, 마지막 헹굼 단계에서 70% 알코올로 3회 헹구어 멸균합니다. 챔버를 알코올에 10분 동안 담가 둡니다.

그 다음 챔버와 캡 내부를 10분 동안 UV 광선에 노출시킵니다. 120 °C에서 45분 동안 오토클레이브 멸균합니다. 멸균이 완료되면 이를 건조시킵니다.

이제 배양 챔버 내부의 MEA 표면을 poly D lysine으로 코팅합니다. 본 실험에 사용된 새로운 MEA는 상당히 친유성이므로, 용액을 여러 번 떨어뜨려 코팅하십시오. 전극 그리드에서 용액을 흡입하여 제거합니다.

보관 및 향후 사용을 위해 캡을 씌워 MEA 챔버를 밀봉합니다. 이 절차를 통해 약 12개의 공동 배양을 위한 피질 및 VTA 절편을 얻을 수 있으며, 생후 1~2일 된 건강한 동물을 사용하여 층류 후드(lamina flow hood) 내의 멸균 상태에서 수행해야 합니다. 조직 수집에 소요되는 총 시간은 1시간 미만이어야 합니다. 안락사 후, 먼저 가위로 두 번의 측면 절개를 하여 두피에서 피부를 제거함으로써 뇌 적출을 시작합니다.

미세 안과 가위를 사용하여 두개골을 제거한 후 절개합니다. 소뇌 피질 접합부에서 정중 시상면을 따라 한 번, 관상면을 따라 한 번 절개합니다. 네 개의 두개골 플랩을 모두 뒤집어 뇌를 노출시킵니다. 다음으로 날카로운 스파출러를 사용하여 후각구의 전면을 절단합니다.

그 다음 스패튤라를 뇌 아래쪽으로 4분면 방향으로 전진시킵니다. 뇌를 두개골에서 조심스럽게 들어 올려, 급속 냉각 및 일시 보관을 위해 차가운 가즈(gaze) 용액 속으로 미끄러지듯 넣습니다.

위의 과정을 다른 두 개의 뇌에 대해서도 반복합니다. VTA 조직을 얻으려면, 뇌를 멸균된 건조 페트리 접시에 옮깁니다. 작은 스파출라를 사용하여 각 뇌를 옆으로 약 1cm 정도 부드럽게 밀어 과잉 액체를 제거합니다.

그 다음 면도날을 사용하여 소뇌 높이에서 관상면 수직 절개를 하여 뇌간을 제거합니다. 이제 슬라이싱 과정 동안 뇌를 기계적으로 고정하기 위해 마운팅 디스크 위에 아가 블록을 접착합니다. 그런 다음 작은 스파출라를 사용하여 디스크 위 아가 블록 앞 몇 밀리미터 지점에 순간접착제를 얇게 바르되, 접착제가 아가에 닿지 않도록 주의하십시오.

각 뇌를 전두극(frontal pole)이 아래로 향하도록 옮겨 고정합니다. 전두극이 마운팅 디스크에 접착되었는지, 그리고 복측(ventral side)이 접착제 잔여물 없이 아가(agar)에 닿아 있는지 확인하십시오. 이렇게 하면 절단 중에 적절한 기계적 안정성을 확보하고 절단된 슬라이스를 쉽게 들어 올릴 수 있습니다.

다음으로, 뇌가 장착된 마운팅 디스크를 냉각된 gaze 용액이 채워진 vibram 트레이에 조심스럽게 담가 고정합니다. 그 후, 깨끗하게 세척한 면도날을 사용하여 최고 진동 주파수와 상대적으로 낮은 전진 속도로 중뇌의 400 µm 두께 관상 절편을 절단합니다. 흡입 벌브가 달린 inverted pasta 피펫을 사용하여 VTA가 포함된 절편을 수집하고, 이를 멸균된 냉각 gaze 용액이 채워진 35 x 10 mm 페트리 접시에 옮겨 피질 절편을 준비합니다. 이전의 절단 단계를 반복하되, 피질과 소뇌 사이에 수직 절단을 실시하고 전두극이 위를 향하도록 하여 4개의 뇌를 마운팅합니다.

선조체 수준부터 시작하여 두께 350 µm의 관상면 절편을 약 3개 수집합니다. 이제 부러진 면도날로 만든 마이크로 나이프를 사용하여, 실체 현미경 하에서 전전두엽 피질과 VTA를 포함하는 중뇌 영역의 너비 약 2 mm 관상면 절편을 박리합니다. 조직 절편을 차가운 가제 용액(gaze solution)이 채워진 작은 접시에 각각 따로 수집합니다.

MEA 챔버의 첫 번째 위치에 조직을 마운팅하기 위해, 먼저 실온에서 스테레오 현미경 아래에 MEA를 두고 전극 어레이가 초점에 맞도록 조정합니다. 그런 다음, 깨끗하고 먼지가 없으며 멸균된 전극 어레이 매트릭스 중앙에 25 µL의 플라스마 방울을 떨어뜨립니다. 소형 스패튤라를 사용하여 피질 및 VTA 섹션을 플라스마 방울 속으로 조심스럽게 밀어 넣습니다.

이제 MEA를 냉각 플레이트에 놓고 시야를 다시 맞춥니다. 플라스마 방울에 25 µL의 thrombin을 추가하기 전, 약 15초 동안 냉각시킵니다. 그런 다음 thrombin 피펫 팁을 사용하여 플라스마-thrombin 혼합물을 MEA 전체에 작은 원을 그리듯 조심스럽게 펴 바릅니다.

부서지기 쉬운 전극 어레이를 직접 만지지 않도록 주의하십시오. 다음으로, 피질의 배측 경계가 어레이의 두 번째 전극 열을 따라 오도록 하여 어레이 위에 조심스럽게 배치합니다. 이렇게 하면 발달하는 표층이 결과적으로 어레이의 나머지 부분을 덮게 됩니다.

그런 다음 VTA를 피질 절편의 복측 경계에 인접하게 배치합니다. 이제 MEA 챔버의 캡을 덮고 느슨하게 닫아 높은 습도를 유지합니다. 플라스마 트롬빈의 응고 및 정착을 위해 MEA 배양 어셈블리를 후드 내 실온에서 약 6분 동안 그대로 둡니다.

그동안 동일한 절차를 반복하여 세 개의 배양액을 추가로 준비합니다. 다음으로, 25 x 5/8 gauge 바늘이 장착된 1 cc 주사기를 사용하여 배양 챔버에 600 µL의 배양액을 소량씩 조심스럽게 첨가합니다. 그런 다음 MEA 챔버를 단단히 닫고, MEA 배양 어셈블리를 인큐베이터 내부의 로킹 보관 트레이에 놓습니다.

체외 배양 2일 후, mitosis 억제제 10 µL를 첨가합니다. 그다음 체외 배양 4일째와 이후 매 4일마다 배양액의 60%를 교체합니다. 정상적인 성장 과정에서 배양물은 상당히 평평해지며 등쪽으로 약간 확장됩니다.

표층 피질층의 발달로 인해, 건강한 배양물은 명시야(brightfield)에서 불투명한 회색 조직으로 식별됩니다. 반대로, 배양 준비 후 약 10일에서 12일이 지나면 죽은 퇴행성 세포의 특징인 밝게 반사되는 소포가 나타나며, 이때 기록 및 자극을 위한 준비가 완료된 것입니다. 기록 세션을 시작하려면, MEA를 보관 트레이에서 기록 헤드 스테이지로 옮깁니다.

국소 전위 또는 LFP를 기록하려면 1~200 Hz의 밴드 패스 필터를 사용하십시오. 다중 단위 활동(Multiunit activity) 또한 300~3000 Hz의 밴드 패스 필터를 사용하여 연구할 수 있습니다. 건강한 자발적 활동은 다양한 크기와 지속 시간의 버스트 형태로 발생하는 경향이 있습니다.

LFP와 단위 활동(unit activity) 사이의 관계를 연구하기 위해, LFP의 스파이크 트리거 평균(spike triggered averages)을 계산할 수 있습니다. 이러한 피질 배양체의 경우, 자극 유발 활동을 기록할 때 음의 LFP 편향이 뉴런의 스파이킹과 상관관계를 보입니다. 먼저, 자극 발생기를 제어하는 소프트웨어를 사용하여 자극의 시간적 파형과 진폭을 지정합니다.

유용한 자극 패러다임은 양극 사각 파형을 이용한 전류 제어 전하 중성 단일 충격입니다. 다음으로, 자극을 전달하는 데 사용할 전극을 선택합니다. 전형적인 자극 유발 LFP 반응은 자발적 활동 버스트와 유사하게 나타납니다.

블랭킹 회로는 자극 중 증폭기를 분리하여 자극 아티팩트를 줄이고 증폭기의 포화를 방지합니다. 자극 전극은 자극 후 회복하는 데 수 초가 소요되므로 반응 활동 기록에 사용할 수 없습니다. MEA에서는 한 전극의 활동이 다른 부위의 활동과 함께 나타나는 시공간적 클러스터 형태로 발생하는 경향이 있습니다.

동시에, 이러한 활동 기간 동안의 전형적인 LFP 파형을 각 클러스터별로 수 초 간격으로 발생한 세 개의 클러스터를 겹쳐 그려 여기에서 보여줍니다. 여러 음의 sd 임계값을 넘는 NLFP 피크를 추출할 때, 1초의 창 내에서 여러 전극에서 음의 LFP 편향을 확인할 수 있으며, NLFP 피크 시간 형태의 활동은 다양한 전극에서 거의 동시에 발생한 NPS를 점의 열로 나타내는 Rasta를 통해 편리하게 시각화할 수 있습니다. 이러한 활동의 시공간적 조직은 상당히 복잡합니다.

낮은 시간적 해상도에서 어느 정도 균질하게 보이는 컬럼들은 더 높은 시간적 해상도에서는 개별적인 클러스터들로 구성되며, 이러한 구조가 반복됩니다. 공간, GEOTEMPORAL 및 LFP 클러스터의 출현은 피질 네트워크 내에서 매우 조직적으로 이루어집니다. 구체적으로, 이러한 조직화는 뉴런 아발란체(neuronal avalanches)에 대해 척도 불변성(scale invariant)을 보입니다.

이는 주어진 시간 분해능 Delta T에서 클러스터 크기의 확률을 계산함으로써 입증됩니다. 여기서 클러스터는 동일하거나 연속적인 시간 빈(time bin)에서 발생하는 NL FPS로 구성됩니다. 이러한 클러스터의 크기가 클러스터당 총 NFPS 수 또는 클러스터당 통합 NLFP 진폭으로 표현될 때, 클러스터 크기 분포는 -1.5에 가까운 지수를 갖는 멱법칙을 나타냅니다. 이 영상을 시청한 후에는 신경 활동의 자기 조직화를 연구하기 위해 뇌 조직을 정밀하게 해부하고 다중 전극 어레이(multi electrode arrays)에서 배양하는 방법에 대해 충분히 이해하게 될 것입니다.

이러한 방법들은 피질 네트워크에서 자발적 활동과 자극 유발 활동 사이의 관계를 연구하는 데에도 사용되어 왔습니다.