사용하여 여러 개의 CNS 준주로 효율적인 유전자 전달 Utero에서 Electroporation

이 절차의 전반적인 목표는 신경 배아 중추신경계의 유전자 발현을 변화시키는 것입니다. 이를 위해 먼저 시기별 임신 암컷을 확보하여 수술 준비를 합니다. 그 다음, 복부 절개를 통해 자궁각을 노출시킵니다.

배아가 노출되면 DNA를 외측 뇌실, 제3 뇌실 또는 망막하 공간에 주입합니다. 절차의 마지막 단계는 자궁벽을 통해 배아에 전류를 가하는 것이며, 이때 패들 전극의 양극이 원하는 형질전환 부위에 위치하도록 방향을 잡습니다. 최종적으로 면역형광 현미경을 통해 tline kelon dying kelon 및 망막에서 신경 전구세포의 증식, 이동 및 분화를 보여주는 결과를 얻을 수 있습니다.

이 기술이 형질전환 마우스의 퇴행과 같은 기존 방법들에 비해 가지는 주요 장점은 신속하고, 더 높은 처리량의 연구가 가능하며, 비용이 저렴하다는 점입니다. 이 방법은 신경 전구세포, 세포 증식, 세포 운명 결정, 신경 분화 및 세포 이동을 조절하는 유전자가 무엇인지와 같은 신경 발달 분야의 핵심적인 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 기술의 함의는 중추신경계(CNS) 발달 결함을 유발하는 유전적 경로에 대한 더 깊은 이해로 확장될 수 있으며, 이러한 결함의 상당수는 인간의 인지 장애 및 행동 장애로 이어집니다. 이는 중추신경계 발달을 이해하는 데 유용할 뿐만 아니라 그 이상의 가치를 지닙니다.

이 기술은 발달 중인 말초 신경계, 심장 및 태반과 같은 다른 장기 시스템에도 적용할 수 있습니다. 또한 마우스의 질병 모델뿐만 아니라 닭 및 xip와 같은 다른 모델 생물을 연구하는 데에도 적용 가능합니다. 일반적으로 이 기술을 처음 접하는 연구자가 겪는 주요 장애물은 배아의 생존이며, 배아를 조작, 주입 및 처리하는 동안 세심한 주의가 필요합니다.

우리는 처음 배아, 말단뇌 및 망막에서 유전자 발현을 조작할 수 있는 신속한 수단이 필요했을 때 이 방법의 아이디어를 얻었습니다. 우리는 2001년 Developmental Biology 저널에 게재된 Sal이 처음 기술한 기법을 수정하여 우리 실험실에서 이 기술을 개발했습니다. 또한 우리는 발달 중인 dilon에서도 이 프로토콜을 확립하기 위해 crash lab과 협력했습니다.

주입 및 전기천공 단계는 배아를 매우 세밀하게 조작해야 하며 때로는 주입 부위가 매우 작을 수 있어 학습하기 어렵기 때문에, 본 방법의 시각적 시연이 매우 중요합니다. 예를 들어 망막하 공간이 그러합니다. 오늘 이 절차를 시연할 사람은 Sherman 연구실의 박사후연구원인 Rajiv입니다. 우선 모든 수술 도구를 세척하고 멸균하십시오. 다음으로, 시린지에 식염수와 젖산 링거액을 채운 후 수술 구역의 가열 패드 위에 올려 따뜻하게 유지하십시오.

가열 패드를 70% ethanol로 멸균한 후, 멸균된 린트 없는 거즈 패드로 덮습니다. 가열 패드의 온도를 37 °C로 설정합니다. 동물을 소형 마취 챔버에 넣고, 기화기를 통해 분당 1 L의 산소와 함께 5% isof fluorine을 투여하여 마취시킵니다.

스캐빈징 시스템을 사용하여 이소플루레인 배기 가스를 반드시 수집하십시오. 동물의 호흡이 깊고 규칙적이 되면 챔버에서 꺼냅니다. 발가락 꼬집기와 눈 깜빡임 반사를 사용하여 확인하십시오.

완전한 마취 상태를 유지하기 위해, 마취된 동물을 복와위로 눕히고 수술 중에 호흡기 튜브를 사용하여 2.25% 이소플루레인(isoflurane)을 투여합니다. 체중 1kg당 0.1mg 농도의 부프레노르핀(buprenorphine)을 목덜미에 피하 주사합니다.

동물의 호흡을 계속 모니터링하고 필요 시 isof fluorine의 유량을 조절하십시오. 그런 다음 마취된 동물의 가슴 부분을 테이프로 고정하고, 둔단 포셉으로 뒷발을 집어 수축 반응이 있는지 다시 확인하십시오. 멸균 면봉을 사용하여 복부에 de cream을 두껍게 펴 바르며, 속털이 완전히 덮이도록 하십시오.

크림을 약 3분 동안 도포한 후, 간헐적으로 제모 상태를 확인하십시오. 멸균 면봉을 사용하여 멸균 거즈 패드에 멸균수를 적신 뒤 복부의 털을 닦아냅니다. 그다음, 클로르헥시딘과 물을 더 사용하여 절개 부위를 소독하십시오.

깨끗한 멸균 거즈로 복부를 건조합니다. 멸균된 새 면 거즈에 70% ethanol을 적셔 이 단계를 반복합니다. 자궁각을 노출시키기 위해 수술복을 착용하여 수술 준비를 합니다.

먼저, 정중선 피부 아래의 희미한 선인 백선을 찾습니다. 핀셋을 사용하여 피부를 복벽에서 들어 올린 다음, 곡선 핀셋과 피부 가위를 이용해 복부 중앙에서 아래쪽으로 작은 직선 절개를 가합니다. 복막에 대해서도 동일한 과정을 반복합니다. 핀셋으로 복막을 잡습니다.

살짝 잡아당긴 후 자궁을 끌어낼 수 있을 만큼만 절개합니다. 작은 수직 절개선이 있는 멸균 거즈를 절개 부위 위에 놓고 따뜻한 멸균 식염수로 적십니다. 다음으로, 포셉을 절개 부위로 밀어 넣고 포셉으로 절개 부위를 벌린 상태에서 자궁의 위치를 찾습니다.

첫 번째와 두 번째로 보이는 배아 사이의 자궁을 잡고 자궁각의 양쪽 끝을 거즈 위로 끌어당깁니다. 흡수된 배아나 크기가 작은 배아가 있는지 확인하며 배아의 수를 셉니다. 정확한 횟수의 DNA 주입을 준비하기 위해, 자궁각을 식염수로 적신 후 한쪽 자궁각을 복강 내로 조심스럽게 되돌려 놓습니다.

수술용 바늘을 로딩하려면, 마우스피스가 부착된 파스퇴르 피펫을 사용하여 메틸 그린 염료가 포함된 3 mg/mL 농도의 엔도톡신 제거 DNA 용액 10 µL를 흡입한 후, 이를 수술용 바늘 안으로 배출하십시오. 이렇게 채운 첫 번째 바늘을 마이크로 매니퓰레이터에 장착하십시오.

난소에 가장 가까운 배아부터 시작하여 인젝터에 맞춥니다. 원형 포셉을 사용하여 탈락막 내의 배아를 조심스럽게 돌려 앞면이 보이게 배치함으로써, ROS 롤에서 탯줄 방향으로 주입이 이루어지도록 합니다. 광섬유 광원을 사용하여 배아 뇌의 정중선을 확인합니다.

吻측 영역에서 양측으로 위치한 확장된 측뇌실을 확인하십시오. 만곡 핀셋을 사용하여 배아를 고정하고, 뇌로 진입하는 각도가 약 45도가 되도록 충전된 수술용 바늘을 자궁 위에 배치하십시오. 빠르고 안정적인 동작으로 마이크로 매니퓰레이터의 다이얼을 돌려 바늘 끝을 자궁벽과 배아 뇌의 측뇌실 내부로 삽입하십시오.

다음으로, 마이크로 인젝터의 풋패드를 누릅니다. DNA 용액을 주입할 때, 메틸 그린 염료가 배아 뇌실 전체로 퍼지는 것을 통해 주입 성공 여부를 쉽게 확인할 수 있습니다. DNA 주입이 완료되면, 파손이 일어나지 않도록 바늘을 천천히 위로 당겨 제거합니다.

주입된 배아를 멸균 거즈 위에 놓고 따뜻한 식염수로 충분히 적십니다. 트랜스펙션하려는 원하는 부위에 패들 전극의 양극을 배치하여 자궁을 잡습니다. 그런 다음 40~50 V의 전압과 50 ms의 세기로, 초당 1회의 속도로 5회의 사각형 전기 펄스를 가합니다.

주입 및 전기천공이 완료된 배아를 보호용 젖은 거즈로 덮은 다음, 다음 배아의 주입을 진행합니다. 자궁각 내의 모든 대상 배아에 대한 주입과 전기천공이 완료되면, 자궁각을 조심스럽게 체강 안으로 밀어 넣습니다. 두 번째 자궁각을 꺼내어 남은 배아들의 주입 및 전기천공을 시작합니다.

모든 배아를 자궁 내로 다시 넣은 후, 복강에 2~3 mL의 따뜻한 식염수를 추가하고, 복부의 거즈를 제거하여 복막의 측면이 드러나게 합니다. 검은색 땋은 실크사를 사용하여, 흉골에서 가장 가까운 복막에 실을 고정시킨 후 고정 지점에서 멀어지는 방향으로 꿰매어 복막을 봉합합니다. 모든 봉합사가 단단히 조여졌는지, 그리고 하부 장기나 피부가 복막에 함께 꿰매어지지 않았는지 확인하십시오.

남은 봉합선을 자르고 제거합니다. 피부 폐쇄용 스테이플러와 포셉을 사용하여 봉합선 위로 피부를 끌어당겨 닫아줍니다. 이때 아래쪽의 봉합선이 함께 스테이플링되거나 피부가 너무 세게 당겨지지 않도록 주의하며 피부를 고정합니다.

완료되면, 여기의 봉합 도구로 살짝 눌러 스테이플이 단단히 고정되었는지 확인하십시오. GFP 발현을 유도하는 두 개의 발현 벡터 A-P-C-I-G가 E 12 시기의 발달 중인 신피질에 전기천공법으로 도입되었습니다. 신피질 발달이 진행됨에 따라, 정단 전구세포는 이차 기저 전구세포 또는 분열 후 뉴런으로 분화하며 계속해서 GFP를 발현합니다. 이후 이러한 신경 세포들을 분석하여 빨간색으로 표시된 신경 아형의 전형적인 마커 발현 여부를 확인할 수 있습니다.

E 12에 전기천공을 실시하고 E 14에 적출한 배아의 전뇌 복측 모습에서, 전기천공 부위는 E 14의 녹색 에피형광으로 표시되어 있습니다. GFP 발현이 시상, 전시상 및 시상하부에서 관찰되며, 이는 해당 영역들이 성공적으로 형질전환되었음을 나타냅니다. 점선 상자는 하나의 뇌실 구역을 가로지르는 절단면의 위치를 나타냅니다.

뇌실 구역(ventricular zone)을 자세히 살펴보면 GFP 세포가 뇌실 구역에서 외투 구역(mantle zone)으로 이동하는 것을 확인할 수 있습니다. E 15.5에 PCIC로 전기천공을 실시한 E 16.5 배아의 관상면 절편에서 보이듯, 시상하부 핵이 형성될 부위와 배아 망막 또한 쉽게 전기천공이 가능합니다. 여기서 m cherry 양성 세포의 축적은 외신경모세포층(outer neuroblast layer)에 특이적으로 나타나며, 신경절 세포층(ganglion cell layer)의 Brn3b 양성 망막 신경절 세포에서는 관찰되지 않습니다. 이 기술을 숙달하면 예상치 못한 합병증이 발생하지 않는 한 30분 이내에 완료할 수 있습니다.

이 절차를 수행할 때는 적절한 멸균 기술을 사용하고, 배아를 조작할 때 손이 떨리지 않도록 주의하며, 임신한 암컷에게 마취제를 투여하기 전에 필요한 모든 재료를 준비하는 것이 중요합니다. 이 절차 이후, 전기 천공된 배아를 성체까지 성장시킬 수 있으며, 이때 행동 및 기능 분석과 같은 다른 방법을 수행하여 배아기 특정 유전자의 조작이 성체의 신경 세포 기능에 어떤 영향을 미치는지에 관한 추가적인 질문에 답할 수 있습니다. 개발된 이후, 이 기술은 CNS 발달 분야의 연구자들이 마우스의 in vivo에서 유전자 기능을 탐구할 수 있는 길을 열어주었습니다.

이 영상을 시청하신 후에는 외래 DNA를 배아 신경관에 도입하는 방법에 대해 충분히 이해하시게 될 것입니다. 구체적으로, 수술을 위한 임신한 암컷의 준비 과정, 자궁 노출, DNA 주입 및 배아 전해질 처리 방법을 보여드립니다.

이소플루오린(isof fluorine)을 사용하는 것은 위험할 수 있으므로, 이 절차를 수행하는 동안 스캐빈징 시스템(scavenging system)과 같은 예방 조치를 취해야 함을 잊지 마십시오.