엑소좀 분리: 배양된 세포의 컨디셔닝된 배지에서 엑소좀을 분리하기 위해 설탕 쿠션을 사용하는 밀도 기반 초원심분리 기법

기능성 생체 분자를 운반하는 나노 크기의 막 결합 소포인 엑소좀은 대부분의 세포 유형에서 활발하게 분비되며 시험관 내 세포 배양 상청액에서 분리될 수 있습니다. 엑소좀을 분리하려면 먼저 관심 있는 세포 배양에서 상청액 또는 컨디셔닝된 배지를 수확합니다. 컨디셔닝된 배지에는 엑소좀, 단백질, 세포 파편 및 소포가 포함됩니다.

배지를 원심분리하여 세포 파편을 펠릿화합니다. 엑소좀 함유 상청액을 수집하고 세포 스트레이너를 통해 여과하여 더 큰 소포를 제거합니다. 여과된 배지의 특정 부피를 새 튜브로 옮깁니다. 다음으로, 적절한 농도의 자당과 산화중수소를 혼합하여 자당의 불연속적인 구배인 자당 쿠션을 준비합니다.

특정 부피의 자당 쿠션 용액을 배지 함유 튜브에 첨가하고; 용액은 바닥에 별도의 층을 형성합니다. 이제 튜브를 고속으로 원심분리합니다. 자당 쿠션은 엑소좀 무결성을 유지하면서 배지에서 자당 용액으로의 엑소좀 이동을 촉진합니다. 고밀도 단백질 오염 물질은 자당 용액과 배지 사이의 계면을 차지합니다.

엑소좀 함유 자당 층의 주요 부분을 적절한 완충액이 있는 신선한 튜브로 조심스럽게 옮깁니다. 고속으로 원심분리하여 정제된 엑소좀 펠릿을 얻습니다. 자당 함유 상청액은 단백질 오염 물질과 함께 버리십시오. 엑소좀 펠릿을 완충액에 재현탁하고 추가 사용할 때까지 저온에서 보관합니다.

수집된 컨디셔닝 배지를 미리 제거하려면 섭씨 4도에서 5분 동안 500 x g으로 원심분리합니다. 상청액을 새 튜브로 옮기고 펠릿을 버립니다. 회수된 상청액으로 이 원심분리 단계를 반복한 후, 상청액을 다시 회수하고 펠릿을 버립니다.

그런 다음 회수된 상청액을 2,000 x g에서 섭씨 15분 동안 4도에서 원심분리합니다. 상청액을 유지하고 펠릿을 버립니다. 20밀리리터 주사기에 부착된 0.22마이크로미터 필터를 통해 상청액을 신선한 원심분리기 튜브에 한 번 여과합니다.

한편, 산화중수소에 25% 자당 용액을 준비하려면 범용 튜브에 자당 1.9g의 무게를 정확하게 측정합니다. 그런 다음 무게가 7.6g이 될 때까지 산화중수소를 첨가합니다. 그런 다음 초원심분리기 튜브에 22.5밀리리터의 사전 정화된 컨디셔닝 배지를 채웁니다.

튜브에 유리 피펫을 넣습니다. 피펫을 통해 자당 용액 3밀리리터를 첨가하여 용액이 조절된 배지 아래에 별도의 층을 형성하도록 합니다. 층상 컨디셔닝된 중간 자당 용액이 들어 있는 튜브를 스윙 아웃 로터의 버킷에 조심스럽게 넣습니다.

버킷을 로터에 고정합니다. 로터를 초원심분리기에 넣고 섭씨 4도에서 1.5시간 동안 100,000 x g으로 회전시킵니다. 팁이 10마이크로리터 팁에 부착된 P1000 피펫을 사용하여 튜브에서 자당 층 2밀리리터를 한 번에 1밀리리터씩 수집하고 세척을 위해 20밀리리터의 여과된 PBS가 들어 있는 초원심분리기 병에 추가합니다.

튜브를 고정각 로터에 넣고 섭씨 4도에서 100,000 x g으로 1.5시간 동안 원심분리합니다. 10밀리리터 혈청학적 피펫을 사용하여 상청액을 조심스럽게 제거합니다. 400마이크로리터의 여과된 PBS로 펠릿을 재현탁합니다.