마우스 뇌에서 단핵 세포 분리: 뇌 상주 단핵 세포를 분리하기 위한 밀도 구배 원심분리 기술

JoVE Encyclopedia of Experiments

Cancer Research

0 조회수 • 4:11 분 • April 30th, 2023

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림프구와 단핵구로 구성된 뇌의 단핵 세포는 뇌 기능과 항상성을 유지하는 데 중요한 역할을 합니다.

이러한 단핵 세포를 분리하려면 먼저 식염수를 관류한 갓 채취한 쥐 뇌를 채취합니다.

관류를 통해 혈관에서 혈액과 그 성분을 제거할 수 있어 후속 단계에서 뇌 상주 면역 세포를 분리할 수 있습니다.

이제 적절한 배지로 뇌를 헹구어 부착된 적혈구를 제거합니다. 작은 조직 조각을 얻기 위해 다진 것으로 헹구십시오.

조직 조각을 균질화하여 단일 세포와 세포 조각의 현탁액을 얻습니다.

이 현탁액에 냉각된 배지와 적절한 밀도 구배 배지를 적절한 부피로 첨가하여 저밀도 구배 배지를 형성합니다.

그런 다음 특정 부피의 고밀도 그라데이션 매체를 추가합니다. 고밀도 그라데이션 미디어는 하단에 별도의 레이어를 형성하여 불연속적인 밀도 그라데이션을 만듭니다.

고속 및 저온 조건에서 현탁액을 원심분리합니다. 단핵 세포는 두 개의 밀도 구배 배지 층 사이의 계면을 차지합니다.

세포 파편과 미엘린(신경 세포 축삭을 둘러싸고 있는 지방 조직 덮개)이 포함된 최상층을 버립니다.

계면 층을 적절한 배지와 원심분리기가 들어 있는 새 튜브로 옮깁니다.

정제된 단핵 세포는 펠릿으로 침전되며 추가 분석을 위해 완충액에 재현탁될 수 있습니다.

두개골을 코에서 목까지 조심스럽게 자르고 두개골 상자에서 각 동물의 뇌를 10밀리리터의 RPMI 배지가 들어 있는 개별 50밀리리터 튜브로 옮깁니다.

튜브를 잘 섞어 부착된 적혈구를 제거하고 흡인으로 배지를 제거합니다. 각 튜브에 10밀리리터의 신선한 배지를 넣고 뇌를 개별 100밀리미터 접시에 옮깁니다.

면도기로 각 뇌를 잘게 자르고 플라스틱 피펫을 사용하여 한 번에 한 접시에서 6밀리리터의 배지에 얼음처럼 차가운 7밀리리터 소결 유리 균질화기로 한 번에 한 접시의 조직을 옮깁니다.

현탁액이

균질해질 때까지 조직을 가져오기 위해 "단단한" 플런저를 사용하기 전에 유봉의 "느슨한" 플런저를 사용하여 뇌를 갈아줍니다. 그런 다음 생성된 조직 슬러리를 얼음 위에 미리 냉각된 15밀리리터 원뿔형 튜브에 붓습니다.

모든 샘플이 균질화되면 튜브당 3밀리리터의 100% 기저막 매트릭스가 포함된 새로운 냉각된 15밀리리터 튜브에 각 조직 현탁액을 추가하기 전에 신선한 배지로 각 튜브의 부피를 7밀리리터로 조정합니다.

몇

번 반전하여 혼합하고 3밀리리터 피펫을 사용하여 각 조직 용액 샘플 아래에 1밀리리터의 70% 밀도 구배 용액을 조심스럽게 천천히 추가합니다.

밀도 구배 원심분리로 세포를 분리하고 모든 미엘린을 완전히 제거하도록 주의하면서 거의 모든 최상층을 제거합니다.

인터페이스를 새 15밀리리터 튜브로 옮기고 신선한 배지로 부피를 10밀리리터로 조정합니다. 그런 다음 샘플을 다시 원심분리하고 상청액을 제거한 후 튜브당 약 100마이크로리터의 배지에 펠릿을 재현탁합니다.

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