를 사용하여 연령에 의존 게놈의 불안정성 유학 S. cerevisiae 연대기 수명 모델

이 절차의 전체적인 목적은 연대적 수명(chronological lifespan)과 일련의 간단한 DNA 손상 및 돌연변이 분석법을 결합하여 효모의 연령 의존적 게놈 불안정성을 연구하는 것입니다. 이는 먼저 2일마다 연대적 노화 배양물을 샘플링하고, 집락 형성 단위(colony forming unit) 또는 CFU 형성을 통해 생존력을 확인함으로써 수행됩니다. 절차의 다음 단계는 노화 배양물을 샘플링하고 세포를 돌연변이 특이적 선택 배지에 도말하여 DNA 돌연변이를 검사하는 것입니다.

최종적으로, 돌연변이 분석 결과를 생존율로 표준화함으로써 효모의 시간적 노화 과정 중 DNA 돌연변이의 변화를 보여주는 결과를 얻을 수 있습니다. 이 방법은 노화와 게놈 불안정성을 연결하는 메커니즘과 같이 노화 분야의 핵심 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 효모의 시간적 수명(chronological lifespan, CLS)을 측정하려면, 먼저 단일 효모 콜로니를 1 mL의 합성 완결 글루코스 배지(synthetic complete glucose medium) 또는 SDC 배지에 접종하고 30 °C에서 하룻밤 동안 흔들어 배양합니다. 다음 날, 하룻밤 배양한 배양액을 신선한 SDC 배지 10 mL에 OD 600이 0.05에서 0.1이 되도록 희석한 후, 30 °C에서 3일 동안 흔들어 배양합니다.

세포가 정지기에 접어드는 3일 차에, 각 Eloqua를 오토클레이브 멸균수로 10,000배 희석합니다. 그다음 플라스크에서 10 µL 분주액 두 개를 취하여, 희석된 배양액 각각 10 µL를 A-Y-E-P-D 플레이트에 도말합니다. 콜로니가 형성될 때까지 플레이트를 30 °C에서 배양합니다. 3일 차 배양액에서 형성된 콜로니 수 또는 콜로니 형성 단위(CFU)를 100% 생존율로 간주합니다.

이후 며칠 동안 도말을 위해 노화 배양액에서 일정량의 aliquot을 계속 채취합니다. CFU 분석에서 약 20~100개의 콜로니가 형성될 수 있도록 희석 배수를 적절히 조절하십시오. 샘플링은 배양액의 생존율이 1% 미만으로 떨어질 때 중단하며, 이는 보통 11일에서 13일 사이에 발생합니다. 세포 생존율은 플레이트에서 노화된 세포에서도 연구할 수 있습니다.

이 분석을 시작하려면 단일 콜로니를 1 mL의 합성 완전 글루코스 배지에 접종하고, 30 °C에서 진탕 배양하며 하룻밤 동안 배양합니다. 배양액이 mL당 약 10⁸ cells까지 성장하면, 오토클레이브 멸균수를 사용하여 배양액을 10 µL당 100~200 cells 및 10 µL당 1000 cells가 되도록 희석합니다. 각 균주에 대해, 도말 밀도에 따라 라벨을 부착한 8~20개의 트립토판 결핍 SDC 플레이트 세트를 준비합니다.

노화 과정 중 생존력 감소를 예상하여 10~100개의 콜로니를 계수할 수 있도록, 희석된 배양액 10~30 µL를 두 번에 나누어 각 플레이트에 도말합니다. 수명 분석 기간 동안 플레이트 세트를 30 °C에서 배양하며, 도말 당일과 이후 2일마다 플레이트 하나를 꺼내 생존 세포가 성장할 수 있도록 0.5 mL의 트립토판(tryptophan)을 한 방울씩 첨가합니다. 해당 플레이트를 30 °C에서 48~72시간 동안 추가로 배양합니다.

48~72시간 후, 트립토판이 첨가된 날의 생존력을 확인하기 위해 CFU를 측정하여 연대적 노화 과정 중의 DNA 손상 및 돌연변이 빈도를 분석합니다. 효모 CLS 분석을 위해 특수 특성을 가진 여러 균주를 야생형 균주와 병행하여 배양합니다.

자발적 돌연변이 빈도는 시간 경과에 따라 노화되는 배양액에서 L-canavanine 내성 빈도를 측정하여 평가할 수 있습니다. 세포막 arginine permease를 인코딩하는 can1 유전자의 돌연변이는 세포를 arginine 유사체인 L-canavanine에 내성이 있게 만듭니다. Canavanine 내성 세포는 L-canavanine sulfate가 첨가된 arginine 결핍 합성 완전 배지(Synthetic complete medium) 플레이트에서 성장합니다. trip1 코딩 서열에 amber 돌연변이가 포함된 균주에서 trip+ 복귀 빈도를 측정함으로써 효모의 시간적 노화 과정 중 염기 치환율을 추정할 수 있습니다.

양성 회귀 세포는 트립토판 결핍 배지에서 성장할 것입니다. 용해 음성 균주 EH150은 오픈 리딩 프레임(open reading frame)에 +4 shift가 있어 라이신 결핍 상태가 되며, 이는 작은 삽입 또는 결실 돌연변이에 의해 회복될 수 있습니다. 거대 염색체 재배열(gross chromosomal rearrangements) 또는 gcr을 검출하기 위해 라이신 결핍 배지에서 회귀 변이체를 선택할 것입니다.

염색체 5번의 can1에서 텔로미어 방향으로 7.5 kilobases 떨어진 곳에 위치한 HX T 13이 U3 카세트에 의해 파괴된 돌연변이 균주가 사용됩니다. can1과 U3 유전자 모두에 발생한 돌연변이는 세포를 각각 L-Canavanine과 5-fluoroorotic acid에 내성을 갖게 합니다. 두 유전자 모두에서 점 돌연변이가 발생할 빈도는 낮기 때문에, L-Canavanine과 5-fluoroorotic acid 모두에 대한 내성 빈도를 분석함으로써 상동 및 비상동 재조합 수준을 모니터링하기 위한 gcr 추정치를 제공할 수 있습니다. 시간적 노화 과정 동안, 100% 상동 역반복 서열 또는 91% 상동 서열을 갖는 돌연변이체가 생성됩니다.

his3 유전자 좌위의 IRS 간 재조합을 통해 기능적인 his3 단백질이 발현됩니다. 따라서 재조합이 일어난 세포는 갈락토스가 보충된 히스티딘 결핍 배지에서 성장하게 됩니다. 세포가 정지기에 접어드는 3일 차에, 각 노화 배양액에서 적절한 양의 세포를 채취합니다.

모든 분석에 동일한 절차가 사용되므로, 하나의 샘플만 처리하겠습니다. 이 영상의 목적을 위해 벤치탑 원심분리기로 원심분리하여 세포를 펠렛화합니다. 상층액을 제거하고 1 mL의 오토클레이브 멸균수에 세포를 재현탁합니다.

다시 상층액을 제거하고 세포 펠릿을 100 µL의 물에 재현탁한 후, 원하는 복귀 돌연변이체를 선별하기 위해 적절한 플레이트에 세포를 도말합니다. 플레이트를 30 °C에서 배양하고 3~4일 후에 CFU를 측정하며, 돌연변이 빈도는 생존 세포 수로 표준화합니다. 이 그래프는 야생형 세포의 연대적 생존율을 S CH nine delta TOR one delta 및 RAs two delta 돌연변이체의 생존율과 비교한 일반적인 연대적 수명 분석의 대표적인 결과를 보여줍니다.

액체 배양에서 TOR1, SCH9 또는 RAS2가 결핍된 돌연변이체는 연장된 연대적 수명을 보입니다. 또한, SCH9와 RAS2의 결핍은 다양한 탄소원이 존재하는 상태에서 연대적 생존 능력을 촉진하는 가산적 효과를 나타냅니다. NC2 생존력 분석법을 사용한 결과가 다음 그래프에 제시되어 있습니다.

1일 차에, SDC 야생형 배양물을 희석하여 탄소원이 없는 SC trip dropout 플레이트에 도말하였습니다. glucose, ethanol 또는 glycerol이 보충된 SC Tripp dropout 플레이트를 30 °C에서 이틀마다 배양하였습니다. 각 세트에서 플레이트 하나를 회수하고, 성장이 가능하고 콜로니가 형성될 수 있도록 적절한 영양분을 추가하였습니다.

연령에 따른 돌연변이 빈도는 균주, 배경, 유전자 조작, 배양 조건 및 연령에 따라 크게 다릅니다. 이 표는 야생형 균주에서 얻은 전형적인 결과물들을 보여줍니다. 트랜스 병변 합성의 대표적인 결과는 다음 이미지에 제시되어 있습니다.

연령에 따른 돌연변이 빈도의 증가는 핵 추출물과 다양한 DNA 템플릿을 이용한 잘못된 DNA 복구의 변화와 관련이 있을 수 있습니다. 우리는 시간적으로 노화된 세포에서 번역 합성 또는 TLS를 평가할 수 있습니다. 정지기에 도달한 3일 된 야생형 및 SCH9 결손 돌연변이 세포의 핵 추출물을 분석하였습니다.

손상되지 않은 템플릿을 가진 TLS 생성물은 실선으로, 손상된 템플릿을 가진 TLS 생성물은 점선으로 표시됩니다. 수명이 긴 s CH nine delta 돌연변이체의 핵 추출물에서는 trans lesion 합성이 관찰되지 않았으며, free primer는 열린 화살표로 표시됩니다. 이 영상을 시청한 후, 효모의 연대적 수명 및 DNA 돌연변이 분석을 수행하는 방법에 대해 충분히 이해하게 될 것입니다.