CRISPR 간섭 기반 유전자 침묵: 병원성 렙토스피라에서 유전자 기능의 표적 억제를 위한 기술

CRISPR 간섭 또는 CRISPRi는 유전자 기능을 억제하는 표적 유전자 침묵을 위해 Cas9의 비활성화된 변이체인 dCas9를 사용합니다.

CRISPRi를 수행하려면 대장균과 렙토스피라 박테리아 모두에 해당하는 복제 기원을 포함하는 플라스미드인 셔틀 벡터 구조물을 사용하여 두 종 모두에서 번식을 촉진합니다.

는 또한 표적 서열을 인식하기 위해 dCas9 유전자에 특이적인 서열과 단일 가이드 RNA 또는 sgRNA를 포함합니다.

처음에 셔틀 벡터는 기증자 E. coli 내부에 존재합니다. 접합을 촉진하기 위해 기증자 대장균 배양균을 숙주 렙토스피라로 보충합니다. 접합은 유기체 사이에 직접적인 세포 간 접촉을 확립하여 렙토스피라에 의한 셔틀 플라스미드 흡수를 촉진합니다. 세포 내부에서 플라스미드 구조체는 sgRNA 서열을 생성하고 dCas9 단백질을 발현합니다.

sgRNA는 렙토스피라 DNA의 상보적 표적 영역을 인식하는 프로토스페이서 영역을 포함하며, 프로토스페이서 인접 모티프 또는 PAM 근처(숙주 DNA의 짧은 인식 서열)에 있습니다. 이는 dCas9가 유전자 전사 시작 부위의 하류에 있는 표적 부위에서 sgRNA와 복합체를 형성하는 데 도움이 됩니다.

sgRNA-dCas9 복합체의 dCas9는 DNA 가닥을 절단하는 촉매 활성이 없으며 대신 mRNA 형성 RNA 중합효소 이동에 대한 물리적 장벽 역할을 하여 결국 유전자 전사를 억제합니다. 추가 테스트를 위해 유전자 침묵 렙토스피라를 사용하십시오.

접합을 위해 렙토스피라 세포는 HAN 배지에서 섭씨 29도 또는 37도에서 성장합니다. 접합 하루 전, 기증자 대장균 세포는 디아미노피멜산(DAP) 및 스펙티노마이신이 보충된 LB 배지에서 성장합니다.

다음으로, 접합 당일, 포화 대장균 배양균을 LB와 DAP에서 성장시킵니다. 생물 안전 후드 내부에서 멤브레인 필터를 유리 베이스 위에 놓은 다음 15mL 유리 깔때기를 놓아 여과 장치를 조립합니다. 두 조각 모두 스프링 클램프로 함께 고정됩니다. 그런 다음 유리를 진공 펌프에 연결합니다. 깔때기에 렙토스피라 배양물 5ml를 추가합니다.

다음으로, 관심 있는 플라스미드를 포함하는 대장균 β2163 균주를 추가합니다. 부피는 배양의 광학 밀도에 따라 달라집니다. 우리는 1:1 셀 비율을 목표로 하고 있습니다. 진공 펌프를 돌립니다. 이제 액체가 막을 통과하고 세포가 그 위에 집중됩니다.

필터를 가져다가 박테리아 면이 위로 향하도록 EMJH 플레이트와 DAP에 놓습니다. 플레이트를 섭씨 29도에서 24시간 동안 배양합니다. 그런 다음 플레이트에서 필터를 회수하여 50mL 원추형 튜브에 넣습니다.

1mL의 액체 HAN 배지를 사용하여 피펫팅을 통해 필터에서 세포를 회수합니다. 암시야 현미경으로 회수된 세포를 시각화합니다.

이 단계에서 동등한 수의 대장균과 렙토스피레를 볼 수 있습니다. 100-200마이크로리터를 사용하여 스펙티노마이신을 포함하는 두 개의 HAN 플레이트에 박테리아를 퍼뜨립니다. 이 단계에서는 DAP가 생략되고 대장균이 자라지 않습니다. 플레이트는 섭씨 37도 및 3% CO₂에서 배양됩니다. 식민지는 8일에서 10일 사이에 명백해야 합니다.