원자 힘 현미경을 사용하여 재조합 DNA와 단백질 단지의 시각화

본 절차의 전반적인 목적은 원자힘 현미경(atomic force microscopy)을 사용하여 수성 완충액 내의 DNA 및 단백질과 같은 생체 분자를 실시간으로 이미징하는 것입니다. 이를 위해 먼저 이미징할 생체 분자를 준비합니다. 그다음 원자힘 현미경을 설정하고 FM 캔틸레버 프로브를 배치합니다.

그 후 시료 표면과 관심 생체 분자를 이미징하고 분석합니다. 결과적으로 원자 힘 현미경(atomic force microscopy)을 통해 완충 조건에서 DNA와 단백질, 그리고 불균일한 생체 분자 복합체의 전반적인 크기, 양 및 조직을 보여주는 결과를 얻을 수 있습니다. 이 방법은 샤페론과 코샤페론 복합체가 클라이언트와 형성하는 STO 기하학적 구조는 무엇인가와 같은 분자 샤페론 분야의 핵심 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다.

AFM 및 Kent 레버 프로브 준비 단계는 물리적 조작과 관련된 복잡성 때문에 인쇄된 설명서만으로는 학습하기 어려울 수 있으므로, 이 방법의 시각적 시연이 유용합니다. 절차 시연은 제 실험실의 학생인 Morgan Shannon과 John Gertz가 진행하겠습니다. 우선, 이미징할 단백질 또는 DNA 분자를 분리하여 수성 완충액에 현탁시키십시오. 샘플의 순도를 확인한 후, 샘플이 마이카에 잘 부착되도록 AFM 흡착 완충액에 넣고 얼음 위에서 배양하십시오.

단백질 샘플의 경우, 10 millimolar HEPES 버퍼를 사용하십시오. DNA의 경우, 10 millimolar Tris (pH 7.5), 10 millimolar sodium chloride, 2 millimolar magnesium chloride로 구성된 마그네슘 함유 버퍼가 AFM 프로브 장착에 적합합니다. 액체 셀 프로브 홀더를 해당 캔틸레버 설치 도킹 스테이션에 배치하십시오.

이미징에 사용할 질화물 팁 레버 프로브의 길고 두꺼운 캔틸레버를 찾습니다. 팁이 수직 상태를 유지하도록 주의하며 이를 액체 셀 프로브 홀더로 조심스럽게 옮깁니다. 다음으로, 광학 현미경으로 캔틸레버를 관찰하여 손상이 없는지, 그리고 액체 셀 프로브 홀더에 제대로 안착되었는지 확인합니다.

그런 다음 뉴럴 헤드 클램프 나사를 조여 기기의 도브테일 어셈블리에서 a FM 헤드를 조심스럽게 분리합니다. a FM 헤드를 뒤집어 액체 셀 프로브 홀더를 a FM 헤드 하단의 4개 핀에 단단히 밀어 넣습니다. 마지막으로, a FM 헤드를 기기의 도브테일 어셈블리에 조심스럽게 다시 장착합니다.

시료 이미징 전 FM을 추가로 준비하려면, 온보드 광학 현미경의 노브를 움직여 캔틸레버 팁의 위치를 찾고, 소프트웨어 상의 광학 컨트롤러에 있는 상하 화살표를 조절하여 캔틸레버 팁의 초점을 맞춥니다. 레이저 조절 노브를 사용하여 레이저를 캔틸레버 팁에 정렬하십시오. 이 단계는 프로토콜에서 기술적으로 가장 까다로운 단계 중 하나입니다. 위치 조정은 수동으로 수행되며 정밀한 노브 조절이 필요합니다.

반사 지점과 조명 지점의 레이저를 세밀하게 모니터링하면 정렬 성공 가능성을 높일 수 있습니다. 다음으로, AFM 헤드의 광검출기 노브를 조정하여 광검출기를 중앙에 맞춥니다. 금속 AFM 시료 디스크에 부착하여 갓 떼어낸 MICA 시트를 AFM 홀더 플레이트 상단의 자성 시료 홀더에 배치합니다.

FM 홀더 플레이트를 회전시켜 시료 디스크를 초기 이미징 위치에 맞춥니다. 기기 소프트웨어의 초점 표면 제어 기능을 사용하여 FM 헤드를 MICA 시료 디스크 표면 방향으로 내립니다. MICA 표면의 뚜렷한 특징이나 팁 반사상이 초점에 맞을 때까지, 기기 소프트웨어에서 튜닝 아이콘을 선택하고 캔틸레버를 튜닝합니다.

권장되는 MSNL 또는 SNL 프로브의 공진 주파수는 20~60 kilohertz입니다. MICA 샘플을 이미징하려면 5% peak offset을 선택하십시오. 먼저, 프로브를 MICA 표면에 접촉시키고 초기 스캔 크기를 10 micrometers로, 스캔 속도를 1 hertz로 설정하십시오.

10 µm 영역의 전체 스캔 이미지를 캡처하십시오. 그 후 스캔 크기를 5 µm 및 0.5 µm로 줄여 각 영역의 전체 이미지를 캡처하십시오. 기기 소프트웨어의 분리 아이콘을 한 번 클릭하여 프로브를 분리하십시오.

관심 있는 생체 분자를 이미징하려면, 준비된 시료 5 µL를 신선한 흡착 버퍼 45 µL와 혼합하십시오. 0.5 µg/mL 농도의 생체 분자 포함 용액 50 µL를 MICU 표면에 직접 조심스럽게 첨가하십시오. 시료 내의 생체 분자가 Micah 표면에 부착될 수 있도록 5분 동안 기다리십시오.

그 다음 흡수 버퍼 50~100 µL를 액체 셀 프로브 홀더에 추가로 피펫팅합니다. 피펫 팁이 프로브, FM 헤드 또는 MICA에 닿지 않도록 주의하며, 필요에 따라 광검출기를 재조정하고 레이저를 캔틸레버에 다시 정렬합니다. 그런 다음 기기 소프트웨어를 사용하여 프로브를 다시 연결합니다.

관심 영역을 식별하기 위해 스캔 크기를 늘립니다. 이미징이 완료되면, 기기 소프트웨어의 후퇴 아이콘을 여러 번 선택하여 프로브를 분리합니다. 마지막으로, 증류수를 사용하여 액체 셀 프로브 홀더와 시료 디스크를 철저히 헹굽니다.

그런 다음 압축 공기를 사용하여 시도하십시오. A FM 이미지의 예가 여기에 표시되어 있습니다. 마이카 기판은 DNA와 단백질이 흡착될 수 있는 분자 수준으로 평평한 표면을 제공합니다.

생체 분자 샘플을 분석하기 전 MICA를 이미징하면 음성 대조군을 확보하고 이미징 노이즈를 평가할 수 있습니다. 또한 이는 캔틸레버가 적절하게 튜닝되었으며 이후의 샘플 이미징이 성공적으로 이루어질 것임을 보장하는 지표가 됩니다. 초나선 구조로 추정되는 이중 가닥 플라스마 DNA는 비대칭적인 외형과 이전에는 특징이 없던 Micah 기판 위에 균일하게 증착된 모습으로 쉽게 식별할 수 있습니다.

불연속적인 입자 크기를 가진 단백질 복합체 또한 Micah 기질로부터 독특하게 구별됩니다. 입자 크기의 차이는 시료의 불균질성을 나타내며, 단백질의 화학량론적 기하 구조나 생화학적 활성을 추정하는 데 유용할 수 있습니다. 관찰된 단백질 입자들은 전반적으로 대각선 모양과 일정한 방향성을 보였습니다.

단백질이 Micah 기판 위에서 예상대로 무작위 방향으로 배열되기 때문에 이는 이미징 아티팩트로 나타납니다. 관찰된 아티팩트의 가능한 원인은 물리적인 팁 이상이거나, 팁 컨볼루션(tip convolution)으로 인해 x축 및 y축의 높이 측정 또는 z축 및 상대적 x, y 측정에서 절대 길이 측정 계산이 불가능한 상태에서 지나치게 빠른 스캔 속도로 AFM 이미징을 수행했기 때문일 수 있습니다. 그럼에도 불구하고 이러한 측정값은 이미징된 생체 분자의 생물리학적 특성을 추정하는 데 유용할 수 있습니다. 이 절차를 수행할 때는 기본적인 AFM 절차에 따라 캔틸레버를 정확하게 튜닝하고 광검출기를 정렬하는 것이 중요합니다.

분자 샤페론이 DNA 반응 요소로부터 스테로이드 수용체의 방출에 영향을 미칠 수 있는지와 같은 추가적인 질문에 답하기 위해, 완충액 교환 유체 셀을 사용하는 단계를 포함한 다른 단계들을 추가할 수 있습니다. 이 영상을 시청한 후, 여러분은 완충 조건에서 원자힘 현미경을 사용하여 DNA 단백질과 생체 분자 복합체를 이미지화하는 방법에 대해 더 잘 이해하게 될 것입니다.