무균 실험실 기술 : 도금 방법

[해설자] 본 프로토콜은 박테리아 및 파지와 같은 미생물을 분리, 증식 또는 계수하는 데 사용되는 도말법의 무균 조작법을 다룹니다. 절차에는 단일 콜로니를 분리하기 위한 박테리아 배양액의 획선 도말법(streak plating), 박테리아 농도를 결정하기 위한 부어 넣기 도말법(pour plating), 그리고 생존 박테리아 콜로니를 계수하기 위한 도말 평판법(spread plating)이 포함됩니다. 연한 한천 층(soft agar overlay)은 파지를 분리하고 플라크(plaque)를 계수하는 데 사용되며, 복제 도말법(replica plating)은 세포를 동일한 공간적 패턴으로 한 플레이트에서 다른 플레이트로 옮기는 방법입니다. 결과적으로, 이러한 미생물 배양 기술의 실제 응용 분야는 환경 내 박테리아 식별부터 분자 유전학 및 고속 대량 분석(high throughput bioassays)의 기술적 진보에 이르기까지 다양합니다.

- 일반적으로 이러한 도말법에 익숙하지 않은 개인은 비멸균 표면과의 접촉을 피하면서 신중하고 조율된 움직임으로 조작해야 하기 때문에 어려움을 겪을 수 있습니다. 이러한 일상적인 절차를 익히기 위해서는 교육과 연습이 필요합니다. 실험실 코디네이터인 Kris Reddi 박사가 해당 절차를 시연하겠습니다.

- [Narrator] 바이오하자드 분류, 폐기물 멸균 및 처리 방법을 포함한 실험실 수칙과 안전 주의 사항을 숙지하여 미생물 실험을 시작하십시오. 도말 절차에 필요한 모든 기구, 용액 및 배지가 멸균되었는지 확인하십시오. 또한 깨끗한 작업 공간을 확보하고 소독제로 닦아내십시오. 가스 라인에 연결된 튜브가 달린 분젠 버너를 설치하고, 적절하게 라벨이 붙은 필수 소모품들을 준비하십시오. 항균 비누와 따뜻한 물로 손을 깨끗이 씻으십시오. 먼저 흐르는 따뜻한 물에 손을 적신 다음 비누를 칠해 충분히 거품을 냅니다. 엄지손가락, 손가락 등, 손등, 손톱 밑을 포함한 모든 표면에 마찰이 생기도록 강하게 문지릅니다. 그 다음 남은 비누가 없도록 깨끗이 헹구고 홀더에서 꺼낸 종이 타월로 물기를 닦으십시오. 마지막으로 새 종이 타월을 사용하여 수도꼭지를 잠급니다. 획도말법(Streak Plate Procedure)은 단순한 기계적 분리를 통해 혼합 집단으로부터 박테리아의 순수 배양물, 즉 단일 콜로니(colony)를 분리하기 위해 설계되었습니다. 4°C 냉장 보관함에서 한천 배지 플레이트를 꺼내 실온에서 미리 예열하십시오. 플레이트 도말에 사용할 도구 세트에서 적절한 도구를 선택하십시오. 플레이트 뚜껑에 응결수가 없이 건조한지 확인하십시오. 한천 플레이트 바닥의 가장자리를 따라 라벨을 붙입니다. 숙련된 경우 하나의 플레이트에 여러 샘플을 사용할 수 있습니다. 그런 다음 분젠 버너에 불을 붙여 금속 루프를 화염 멸균합니다. 금속 루프에서 3~4인치 떨어진 곳에서 시작하여, 분젠 버너 화염의 가장 뜨거운 부분인 파란색 원뿔 끝부분에 와이어를 넣습니다. 금속이 빨갛게 달구어지면 루프 쪽에 화염이 닿도록 와이어를 움직입니다. 루프를 식히기 위해 한천 배지의 가장자리에 접촉시키면 지지직거리는 소리가 납니다. 루프에 접종균(inoculum)을 묻힙니다. 플레이트의 하단 절반을 들어 올립니다. 플레이트의 첫 번째 사분면에서 가장자리부터 중심까지 루프를 앞뒤로 움직입니다. 뒤집힌 플레이트를 다시 뚜껑 위에 내려놓습니다. 금속 루프를 다시 화염 멸균합니다. 페트리 접시를 90도 회전시킵니다. 첫 번째 사분면의 마지막 획의 끝부분 근처에 루프를 대고 앞뒤 패턴을 사용하여 이전 획의 마지막 절반과 교차시킨 후, 비어 있는 두 번째 사분면으로 이동합니다. 두 번째 사분면을 다 채우면 플레이트를 내려놓습니다. 첫 번째 사분면과의 접촉을 피하면서 세 번째와 네 번째 사분면에 대해서도 도말 절차를 반복합니다. 멸균된 평평한 이쑤시개로 도말할 때는 좁은 끝부분을 엄지와 약지 사이에 잡고 배지와 10~20도 각도를 유지하며, 넓은 끝부분을 사용하여 각 사분면을 도말합니다. 사분면 사이에서는 플레이트를 다시 뚜껑 위에 뒤집어 놓고 이쑤시개를 적절하게 폐기하십시오. 도말된 플레이트를 뒤집어 배양합니다. 주입평판법(Pour Plate Procedure)은 단일 플레이트의 표면과 한천 내부의 총 콜로니 형성 단위(CFU) 수를 측정합니다. 타이머를 10분으로 설정한 후, 55°C 항온수조에 있던 18mL의 융해된 한천 배지를 48°C 열블록으로 옮겨 10분 동안 평형을 맞춥니다. 멸균된 페트리 접시 바닥에 라벨을 붙입니다. 필요한 경우 희석 배수를 기재하십시오. 이제 페트리 접시 중앙에 샘플 1mL를 분주합니다. 뚜껑을 닫습니다. 융해된 한천 튜브의 캡을 제거하고 열린 튜브의 입구를 화염에 통과시킵니다. 한천을 페트리 접시에 조심스럽게 붓습니다. 뚜껑을 닫은 후 플레이트를 부드럽게 흔들어 샘플과 한천을 섞습니다. 한천이 응고될 때까지 30분 동안 기다립니다. 한천이 응고되면 플레이트를 뒤집어 따뜻한 방에 둡니다. 도말평판법(Spread-plating)은 소량의 샘플 내에 포함된 미생물을 분리하여 결과 콜로니들이 한천 표면에 고르게 분포하도록 하는 것을 목표로 합니다. 플레이트를 실온으로 평형 맞추고 적절하게 라벨을 붙입니다. 플레이트를 턴테이블 위에 놓습니다. 한천 중앙에 샘플 0.1mL를 피펫으로 분주하고 뚜껑을 닫습니다. 팁을 폐기물 용기에 버립니다. 금속 스패더를 70% 에탄올 비커에 담가 스패더의 바닥 전체와 줄기 부분의 처음 1인치까지 덮은 후 꺼내어 흘려보냅니다. 분젠 버너의 화염에 통과시켜 과잉 에탄올을 연소시킵니다. 다음으로 한천 플레이트의 뚜껑을 열고, 가장자리 근처의 한천에 스패더를 접촉시켜 식힙니다. 턴테이블을 천천히 회전시킵니다. 스패더를 한천 표면에 부드럽게 대고, 턴테이블이 회전하는 동안 앞뒤 동작을 사용하여 샘플을 플레이트 전체에 점진적으로 고르게 펴 바릅니다. 뚜껑을 닫고 샘플이 완전히 흡수되도록 최소 5분 동안 둡니다. 그런 다음 뒤집은 플레이트를 배양합니다. 먼저 한천 플레이트에 적절히 라벨을 붙입니다. 한천 플레이트의 뚜껑을 엽니다. 그런 다음 미리 멸균된 유리 구슬 용기를 열고 입구를 화염 멸균합니다. 한천 플레이트에 10~12개의 멸균 유리 구슬을 조심스럽게 분주합니다. 플레이트 뚜껑을 닫고, 캡을 닫기 전 유리 구슬 용기의 입구를 다시 화염 멸균합니다. 이제 한천 중앙에 샘플을 피펫으로 분주합니다. 수평 방향으로 유리 구슬을 한천 표면 위에서 7회 부드럽게 흔듭니다. 제대로 수행되면 마라카스를 흔드는 것과 같은 소리가 납니다. 플레이트를 60도 회전시키고 다시 7회 수평으로 흔듭니다. 다시 플레이트를 60도 회전시키고 흔드는 과정을 반복합니다. 샘플이 흡수되었는지 확인합니다. 그런 다음 오염된 구슬을 10% 염소 표백제가 들어 있는 표시된 수집 비커에 붓습니다. 뒤집은 플레이트를 배양합니다. 플라크 분석법(plaque assay)은 일반적으로 박테리오파지를 검출하고 정량화하는 데 사용됩니다. 지시 박테리아를 대수 증식기까지 배양하여 얼음에 보관합니다. 그런 다음 두 개의 멸균 마이크로 원심분리 튜브에 'phage'와 'control'이라고 라벨을 붙이고, 각각 파지 샘플 또는 버퍼 50µL를 첨가합니다. 다음으로 플라스크 안의 박테리아 배양액을 흔든 후, 박테리아 일부를 멸균 튜브로 옮겨 지시 박테리아를 부드럽게 볼텍싱(vortex)하고, 각 흡착 튜브에 박테리아 500µL를 첨가합니다. 튜브를 가볍게 튕겨 섞습니다. 파지 샘플을 절대 볼텍싱하거나 강하게 피펫팅하지 마십시오. 파지-박테리아 혼합물을 지시 균주에 적합한 온도에서 20분 동안 배양합니다. 그동안 55°C 항온수조에서 소프트 아가(soft agar) 튜브 두 개를 48°C 가열 블록으로 옮깁니다. 10분 동안 평형을 맞춥니다. 실온으로 미리 예열된 응결수가 없는 영양 하드 아가(hard agar) 플레이트 두 개에 라벨을 붙입니다. 가열 블록에서 소프트 아가 튜브를 꺼내 내용물이 만지기에 너무 뜨겁지 않은지 확인합니다. 다음으로 파지 흡착 튜브의 혼합물을 소프트 아가 튜브로 무균적으로 옮깁니다. 그런 다음 손바닥 사이에서 빠르게 회전시켜 내용물을 섞습니다. 한 손에 튜브를 잡고 다른 손으로 하드 아가 플레이트의 뚜껑을 엽니다. 즉시 튜브의 전체 내용물을 하드 아가 플레이트 표면에 붓습니다. 플레이트를 빠르게 그리고 부드럽게 흔듭니다. 뚜껑을 닫고 소프트 아가가 응고될 때까지 수평한 곳에 30분 동안 둡니다. 다음으로 대조군 흡착 튜브에 대해서도 동일한 절차를 반복합니다. 대조군 혼합물을 소프트 아가 튜브로 옮기고, 섞고, 하드 아가 플레이트에 부어 흔든 뒤, 소프트 아가가 30분 동안 응고되도록 합니다. 플레이트에서 플라크(plaque) 형성을 확인합니다. 불균일한 혼합물에서 플라크를 분리하려면, 멸균된 이쑤시개로 중심부를 조심스럽게 찌르고 접종균을 100µL의 파지 버퍼가 들어 있는 멸균 마이크로 원심분리 튜브로 옮깁니다. 필요한 경우 연속 희석과 함께 플라크 분석법을 3~6회 반복하여 이 용해물(lysate)을 계속 정제합니다. 복제 도말법(Replica plating)은 1차 플레이트의 세포 성장과 2차 플레이트의 성장을 비교함으로써 선택 가능한 표현형을 활용하는 방법입니다. 플레이트 바닥에 격자를 표시하고, 1차 플레이트에 라벨을 붙인 후 생성된 각 사각형에 번호를 매깁니다. 이제 무균 조작법을 사용하여 비커에서 미리 멸균된 이쑤시개를 꺼내 각 사각형의 중심을 세포 샘플로 찍고, 이쑤시개를 적절한 폐기물 수거함에 버립니다. 1차 플레이트를 배양합니다. 1차 플레이트와 모든 2차 플레이트를 쌓습니다. 플레이트 하단 측면에 방향 표시를 합니다. 이제 포장지에서 멸균된 벨벳 천을 꺼내 원통형 블록 위에 놓습니다. 다음으로 홀더를 놓아 홀더의 표시와 블록의 표시를 맞춥니다. 블록과 홀더의 방향 표시를 확인하십시오. 다음으로 1차 플레이트의 뚜껑을 제거합니다. 플레이트와 블록의 방향 표시를 맞춥니다. 한천 표면이 벨벳 천에 닿도록 플레이트를 내립니다. 손끝을 사용하여 1차 플레이트 뒷면을 가볍게 그리고 고르게 누른 다음, 블록에서 조심스럽게 들어 올립니다. 벨벳 위에 세포의 각인이 찍혔는지 확인합니다. 플레이트에 뚜껑을 다시 덮습니다. 이제 각 2차 플레이트에 대해 벨벳 천 위에서 이 프로토콜을 순차적으로 반복합니다. 1차 플레이트의 벨벳 세포 각인을 사용하여, 가장 덜 유리한 기질에서 가장 유리한 기질 순으로 배치된 최대 8개의 2차 플레이트에 접종합니다. 마지막으로 양성 대조군으로, 시리즈의 마지막 플레이트에는 테스트된 모든 균주가 성장할 수 있는 한천 배지를 사용합니다. 뒤집은 플레이트들을 테이프로 함께 고정하고 배양합니다. 2차 플레이트의 성장을 확인합니다. 분젠 버너를 끄고 모든 소모품을 정리하십시오. 오염된 실험복, 유리 기구 및 위험 폐기물을 적절한 폐기 용기에 넣으십시오. 작업 구역을 소독제로 닦아냅니다. 마지막으로 항균 비누와 따뜻한 물로 손을 깨끗이 씻으십시오. *Serratia marcescens*는 프로디지오신(prodigiosin)이라는 붉은 색소를 생성하는 그람 음성 간균형 프로테오박테리아입니다. 주로 화장실이나 샤워 커튼에서 자라는 것이 발견됩니다. 이 예시에서 획도말법은 네 번째 사분면에서 단일 콜로니를 생성합니다. 공공 식수대에서 수집한 수돗물 샘플에 존재하는 박테리아 분석에는 주입평판법이 사용되었습니다. 콜로니 외형의 차이에 주목하십시오. 표면 콜로니는 크고 원형인 반면, 일부 표면 콜로니는 매우 작고 불규칙한 모양입니다. 도말평판법은 농축, 선택 및 스크리닝 실험의 중요한 구성 요소입니다. 예를 들어, 코파카바나 방법(copacabana method)은 재조합 DNA 기술의 고전적인 블루-화이트 스크리닝에서 차별화 도구로 사용됩니다. 파지 T4는 독성 이중 가닥 DNA 파지로, 호스트인 *Escherichia coli*를 감염시켜 용해시키고 자손 파지를 방출합니다. EHA 한천에서의 이 플라크 분석은 직경 약 1mm의 투명 구역(zones of clearing)에 파지가 있음을 보여줍니다. 감염성 파지 입자가 없는 경우, 박테리아 성장이 일어나 소프트 아가 내에 세포의 혼탁한 현탁액이 형성되어 개별 콜로니가 보이지 않습니다. 소프트 아가 오버레이 기술에서 플라크의 형태(morphology)는 다양하게 나타납니다. 예를 들어, 여기서는 동일한 마이코박테리아 호스트 균주가 마이코박테리아 파지 destroyers와 마이코박테리아 파지 MSSS가 있을 때 서로 다른 플라크 형태를 생성합니다. 복제 도말법의 위력은 수많은 미생물을 동시에 스크리닝할 수 있다는 점에 있습니다. 이 경우, 4가지 슈도모나스(pseudomonas) 균주를 세 가지 서로 다른 탄소원(아세트아미드, 락토스, 글리신)에서의 성장에 대해 이중으로 테스트했습니다. 여기에서 1차 플레이트는 표시된 4가지 균주가 접종된 완전 YTA 배지입니다. 이 균주들은 단일 탄소원인 아세트아미드, 락토스 또는 글리신이 보충된 최소 MSA 배지 복제 플레이트에서 다양한 성장 패턴을 보입니다. 모든 균주가 마지막 양성 대조군 플레이트에서 성장하여, 이 시리즈의 모든 2차 플레이트로 세포가 성공적으로 옮겨졌음을 확인해 줍니다. 이러한 복제 플레이트 결과의 표 작성을 통해 특성 성장 요구 사항에 대한 서로 다른 야생형 균주의 동시 스크리닝 내용을 상세히 알 수 있습니다.

- 이 영상을 시청한 후에는 배지나 배양물을 오염시키지 않고 플레이팅 절차를 수행하는 방법과 실험실의 각 실험 과제에 적합한 플레이팅 방법을 사용하는 방법에 대해 충분히 이해하게 될 것입니다. 이러한 기술에 능숙해지기 위해서는 연습이 필요합니다. 하지만 적절한 훈련을 거친다면, 이 영상에서 설명하는 플레이팅 절차는 실험실 벤치에서 작업할 때 자연스럽게 익숙해질 것입니다.