사람의 체외에서 억제

이 절차의 전반적인 목표는 인비트로(in vitro) 인간 억제 분석법을 사용하여 Treg 기능을 측정하고, 잠재적인 미래의 기능 상실을 예측하는 것입니다. 이는 먼저 세포 자극제로 사용될 코딩 비드(coded beads)를 준비하고 테스트함으로써 수행됩니다. 두 번째 단계는 순수한 naive CD4+ CD25- T 세포, 인비보(in vivo) 활성화된 CD4+ CD25low T 세포, 그리고 조절 CD4+ CD25high T 세포를 분리하는 것이며, 항원 제시 세포(APC)로 사용하기 위해 방사선 조사된 PP BMC를 준비하는 것입니다.

다음으로, 반응 세포로서 naive 또는 활성화된 T-세포를 사용하고 P BMC를 APC로 사용하는 단일 배양 또는 동일한 조건에서 treg를 1:10 비율로 추가한 공동 배양을 설정합니다. 마지막 단계는 세포를 회수하고 tritiated Thymidine incorporation을 통해 증식 정도를 측정하는 것입니다. 최종적으로 얻은 결과는 naive T-세포 반응과 in vivo에서 활성화된 T-세포 반응의 억제 차이를 보여줄 수 있습니다.

제 이름은 Jeff Woodcliff입니다. 조절 T 세포는 고유한 세포 표면 마커를 발현하지 않습니다. 따라서 이들의 기능을 신뢰성 있게 측정하기 위해서는 최적의 분리 효율을 제공하는 기술을 사용하여 분리해야 합니다.

max isolation과 같은 다른 방법보다 형광 활성 세포 분리법(FACS)을 사용하는 주요 장점은 FACS를 통해 매우 순수한 세포 집단을 얻을 수 있다는 점입니다. 그러면 여기서 입증한 바와 같이, in vitro 억제 분석법을 통해 세포 기능을 신뢰성 있게 테스트할 수 있습니다. 이 방법은 건강한 피험자와 1형 당뇨병 관련 피험자의 treg 기능에 대한 통찰을 제공할 수 있습니다. 또한 인간 류마티스 관절염, 전신성 홍반성 루푸스, 다발성 경화증 및 기타 다른 자가면역 질환에도 적용될 수 있습니다. anti-human CD3로 taal 활성 비드를 코팅합니다.

원래 바이알에서 M four 50 toil 활성 비드 1 mL를 1.5 mL 튜브에 넣고, 모든 비드가 튜브 벽면에 부착될 때까지 튜브를 마그네틱 스탠드에 둡니다. 그런 다음 튜브가 마그네틱 스탠드에 있는 상태에서 피펫팅으로 비드 버퍼를 제거합니다. 이후 튜브를 마그네틱 스탠드에서 꺼내고 버퍼 1 1 mL를 추가합니다.

튜브를 자석 스탠드에 반복해서 놓습니다. 튜브가 자석 스탠드에 있는 동안 버퍼를 제거합니다. 버퍼 1 mL에 비드를 다시 재현탁합니다.

이번에는 anti-human CD3 40 µL를 함께 추가합니다. 비드와 항체를 37 °C에서 15분 동안 교반합니다. 그런 다음 0.1% w/v BSA를 추가하고 향후 16시간 동안 계속해서 교반합니다.

다음으로, 1 mL의 buffer two에 비드를 넣고 2~8 °C에서 5분 동안 반응시켜 비드를 두 번 세척합니다. 그 후 튜브를 마그네틱 스탠드에 둔 상태에서 buffer two를 제거합니다. 그런 다음 동일한 무균 조건에서 비드를 한 번 더 세척합니다.

이번에는 1 mL의 완충액 3을 사용하여, 96-웰 플레이트의 각 웰에 50,000 PBMC를 3회 반복으로 분주하고, 세포당 CD3 코팅 비드의 수를 다양하게 추가하여 항체 코팅 효율을 테스트함으로써 최적의 비율과 ALI를 결정합니다. 37°C에서 72시간 동안 배양한 후, 1 µCi의 삼중수소화 티미딘을 첨가하고 다음 16시간 동안 계속 배양합니다. 멀티스크린 수확 플레이트 또는 이와 유사한 플레이트로 세포를 수확합니다.

섬광액(scintillation liquid)을 첨가하고 웰당 분당 측정치(counts per minute) 또는 CPM을 읽습니다. top count N XT 섬광 계수기 또는 이와 유사한 장비를 사용하여 비드 대 세포 비율을 결정하는데, 저희의 경험상 CPM이 지속적으로 5,000 초과 15,000 미만으로 나타나는 비율을 사용합니다. 테스트한 모든 인간 피험자에서 세포당 비드 3개의 비율이 반응 세포(responder cells)와 treg 세포 모두에 최적의 자극을 제공하는 것으로 나타났습니다.

50 mL 원추형 튜브에 Ficoll-Paque 15 mL를 채웁니다. 그다음, 혈액이 담긴 튜브에 PBS 250 mL를 추가하여 50 mL의 버피코트(buffy coat)를 1:6 비율로 희석합니다. 희석된 버피코트 25 mL를 Ficoll-Paque 층이 흐트러지지 않도록 그 위에 천천히 층을 쌓아 올립니다.

4°C에서 800 ×g로 30분 동안 원심분리합니다. 브레이크 기능을 끈 상태에서, 피콜(fial)과 버퍼 사이의 흰색 중간층인 PBMC 층을 조심스럽게 수집합니다. 필요한 경우, 튜브 벽면에 붙은 세포를 긁어내어 수집합니다.

몇 분 정도 기다린 후 중간층에서 세포를 다시 수집합니다. 세포를 새로운 50 mL 튜브로 옮기고, PBS로 튜브를 채워 세척하여 펠렛 상태로 만듭니다. PBM cs.

세척 단계를 매회 2번씩 반복합니다. 두 개의 세포 펠릿을 하나의 튜브에 합치고, 최종적으로 모든 세포 펠릿을 하나의 50 milliliter 튜브에 합칩니다. 그런 다음, 부유 세포 20 microliters를 사용하여 트라이판 블루 배제법으로 세포 생존율을 측정합니다.

생존 가능한 PBMC 1 mL를 새 튜브로 옮겨 테스트용 APC를 생성합니다. 그런 다음 배지 4 mL를 추가하고 세포에 5,000 rads를 조사합니다. 나머지 PBMC가 들어 있는 튜브의 빈 공간을 PBS 버퍼로 채웁니다. 이후 4 °C에서 250 ×g로 10분간 원심분리한 다음, 상층액을 따라내고 동일한 혼합물 4 mL에 세포를 재부유시킵니다.

그 다음, PBMC에 200 µL의 max anti CD4 microbeads를 첨가하고, 세포와 비드 혼합물을 4 °C에서 20분 동안 배양합니다. 배양 후, 세포를 40 mL의 PBS 버퍼로 세척한 다음 세포를 펠렛화합니다. 이어서 상층액을 따라내고, 실온에서 8 mL의 Degas PBS 버퍼로 세포를 재현탁합니다.

다음으로, 분리 필터를 사용하여 세포 현탁액을 여과 분리합니다. 그런 다음 PBM CS를 15 mL 튜브 두 개에 나누어 담습니다. 각 튜브에 P BMCs 4 mL씩을 첨가합니다.

두 개의 컬럼을 미니맥스 분리기(minimax separator)에 두껍게 고정하고 각 컬럼 아래에 수집 튜브를 배치합니다. 그런 다음 각 컬럼에 3 mL의 DGAs PBS 완충액을 추가합니다. 완충액이 모두 소모되면, 각 튜브에 담긴 4 mL의 세포 용액 전체를 세포 현탁액이 완전히 빠져나가기 전에 컬럼 위에 층지어 가합니다. 각 컬럼에 실온의 DGAs PBS 완충액 3 mL를 추가하고 완충액이 수집 튜브로 모두 흘러내리도록 둡니다.

투명하게 나올 때까지 버퍼를 더 추가합니다. DGAs 버퍼 5 mL를 LS 컬럼에 더 피펫팅한 후, minimax 분리기에서 LS 컬럼을 제거합니다. 컬럼을 새로운 멸균된 50 mL 수집 튜브에 넣습니다.

0.5 mL를 흘려보낸 다음, 나머지 약 4 mL의 부피를 천천히 밀어내십시오. 이제 CD4 양성 분획 두 개를 합칩니다. 그런 다음 튜브에 최대 50 mL의 PBS를 추가하고, 4 °C에서 400 ×g로 10분 동안 원심분리한 후 세포 수를 측정하십시오.

세포를 2 mL의 PBS 완충액에 다시 현탁합니다. FACT 염색에 사용할 항체들(anti-CD14, CD32, CD16 및 선택적으로 anti-CD4)을 하나의 튜브에 혼합합니다. FLUOROCHROME 마이너스 튜브 염색을 위해 이 혼합액의 일부를 분취합니다.

세포 현탁액 1mL당 튜브에서 5µL를 FACS 튜브로 옮겨 FMO 튜브를 준비하고, 이전에 준비한 항체 칵테일 2µL로 세포를 염색합니다. 다음으로, 세포 소팅을 위한 보정 대조군으로 사용할 새로운 개별 FACS 튜브에 미염색 세포와 마우스 IgG가 코팅된 비드를 넣고 단일 형광색소로 염색합니다. 그런 다음 칵테일에 anti-human CD 25 PE 50µL를 추가하고, 이 칵테일을 나머지 세포 현탁액에 넣습니다.

튜브를 4°C에서 30분 동안 배양합니다. 항체 칵테일로 세포를 배양한 후, 세포에 PBS 버퍼를 추가하고 원심분리하여 펠렛을 형성합니다. 펠렛을 10⁷ cells/mL 농도의 PBS 버퍼에 현탁합니다.

FMO 튜브를 사용하여 CD 25 양성 T 세포의 분리를 위한 임계값을 설정하십시오. 이 게이팅 전략을 사용하여, 우선 이 그림에서 보여주는 것과 같이 단핵구, 대식세포 및 모든 기타 CD 4 양성 비 T 세포로 구성된 Fitc 양성 세포를 제외하기 위해 Fitc 음성 세포 주변에 게이트를 설정하십시오. 별도의 플롯에서, 이 그림과 같이 CD 25 음성 및 CD 25 low T 세포와 CD 25 high treg 세포를 위한 게이트를 그리십시오.

유세포 분석 및 세포 하위 집단 분리 후, 수집 튜브를 원심 분리하여 펠릿을 형성하고 도말 전까지 T-세포를 얼음 위에 보관하십시오. 표에 표시된 대로 U-바닥 96웰 플레이트에 라벨을 붙입니다. 웰당 반응 세포 하나당 3개의 비드가 되도록 계산된 10% pooled human AB serum이 포함된 완전 배지 내의 CD3 코팅 비드 50 µL 분주액을 96웰 플레이트에 현탁한 다음, 이전에 방사선 조사한 APC를 배지로 희석하여 5 × 10⁵ cells/mL 농도로 맞춥니다.

96-웰 플레이트에 세포 50 µL를 분주하고, 웰당 2.5 × 10⁴개의 CD4⁺ CD25⁻ 또는 CD4⁺ CD25ˡᵒ T-세포를 3반복으로 추가합니다. 여기에 표시된 대로 1:10 비율로 B행과 'tregs only'로 표시된 웰에 treg를 추가하여 공동 배양합니다. 그런 다음, 5% CO₂와 포화 습도가 유지되는 37 °C 인큐베이터에서 72시간 동안 배양합니다. 다음으로, 1 µCi의 tritium-labeled thymidine을 세포에 처리한 후, 공동 배양의 마지막 몇 시간 동안 thymidine이 통합될 수 있도록 37 °C에서 16시간 동안 추가로 배양합니다.

필터 메이트 하베스터(filter mate harvester)를 사용하여 멀티 스크린 수확 플레이트의 세포를 수확합니다. 그다음, 미리 신틸레이션 용액을 채워둔 투명 플라스틱 커버로 수확 플레이트를 덮습니다. 마지막으로 웰당 CPM을 측정합니다.

신틸레이션 카운터를 사용하면 다음의 도트 플롯 시리즈에서 보는 바와 같이 이 시스템을 통해 T 세포 서브셋을 고순도로 분리할 수 있습니다. 하단 게이트에는 CD four 양성 CD 25 음성 T 세포가 표시되어 있습니다. 다음 그림에서는 고순도로 정제된 CD four 양성 CD 25 low T 세포를 확인할 수 있습니다. 플로우 소팅된 순수한 CD four 양성 집단입니다.

상단 게이트 컨트롤에서 CD 25 high treg 세포가 나타나 있습니다. 건강한 공여자의 APC와 treg 단일 세포 유형 배양에서는 티미딘 통합으로 측정한 결과 배경값 대비 증식이 거의 또는 전혀 나타나지 않은 반면, naive CD 25 negative 및 in vivo 활성화된 CD 25 low T 세포는 뚜렷한 증식을 보였으며, 이러한 반응 세포 유형을 treg 세포와 공동 배양했을 때 증식이 억제되었습니다. 다만, tregs가 반응성 naive CD 25 negative 및 in vivo 활성화된 CD 25 low T-세포를 억제하는 능력에는 약간의 차이가 관찰되었습니다.

이는 유의미한 대조군이 아니었습니다. 고위험군 피험자의 APC 및 Treg 단일 세포 유형 배양에서는 티미딘 통합 측정 결과 배경값 대비 증식률이 거의 없거나 매우 낮게 나타났습니다. 반면, naive CD 25 음성 및 InVivo 활성화된 CD 25 저발현 T 세포는 건강한 대조군에 비해 낮은 수준의 증식을 보였습니다.

분석 결과의 신뢰도가 확보되었으므로, 반응성 T 세포가 tregs 및 공동 배양에 의해 추가로 억제되었음을 확인하였습니다. 또한, 낮은 CPM 값은 신호 전달의 잠재적 결함을 시사하며, 이는 별도의 연구를 통해 추가로 조사되어야 한다는 결론을 내릴 수 있습니다. 다만, 위험군 대상자에서 CD 25 음성 반응성 T 세포와 CD 25 low 반응성 T 세포를 억제하는 tregs의 능력 차이는 유의미했습니다.

이 영상을 시청하신 후, 건강한 대상자 및 제1형 당뇨병 환자와 같이 면역 체계가 손상된 대상자에게서 Treg의 존재 여부를 확인하기 위한 성공적이고 신뢰할 수 있는 기능적 테스트의 모든 필수 단계를 원활하게 연결하는 방법에 대해 충분히 이해하게 될 것입니다.