계면 세포 핵의 기계적 성질을 알아내기 위해 Biophysical Assays : 기판 스트레인 신청 및 Microneedle 조작

다음 실험들의 전반적인 목적은 인터페이스 세포핵의 기계적 특성과 주변 세포골격과의 물리적 연결성을 측정하는 것입니다. 이는 투명한 실리콘 막 위에 배양된 세포에 기계적 변형(strain)을 가하고, 이에 의해 유도된 핵의 변형을 이미징함으로써 수행됩니다. 핵의 변형이 증가할수록 핵의 강성(stiffness)은 감소하는 것에 해당하며, 핵과 세포골격 간 결합의 변화 또한 유도된 핵 변형에 영향을 미칠 수 있습니다.

세포골격에 국소적인 변형을 가하여 세포골격과 핵 사이의 세포 내 힘 전달을 직접적으로 조사합니다. 이후 형광 표지된 NU 핵 및 세포골격 구조의 변위를 이미지화합니다. 이를 통해 주변 세포골격 대비 세포핵의 강성을 나타내는 결과를 얻습니다.

기질 변형 실험을 바탕으로 한 마이크로니들 조작 분석 결과, 핵-세포골격 결합의 붕괴가 세포 내 힘 전달의 결함을 유발한다는 것이 밝혀졌습니다. 분리된 핵의 마이크로 피펫 흡입과 같은 기존 방법과 비교하여 이러한 기술의 주요 장점은, 정상적인 세포 구조를 방해하지 않고 온전한 살아있는 세포 내에서 핵 역학을 측정할 수 있다는 점입니다. 이러한 방법들은 핵막 조성의 변화가 핵의 기계적 특성에 어떻게 영향을 미치는지에 대한 통찰을 제공할 수 있습니다.

이들은 또한 LA 신경병증이나 암과 같은 질환의 맥락에서 핵 역학의 역할을 연구하는 데 적용될 수 있습니다. 각 인장 디쉬는 직경 3인치의 맞춤 제작된 바닥 없는 플라스틱 디쉬와 세포 배양 기질 역할을 하는 실리콘 막을 고정하기 위한 플라스틱 O-링으로 구성됩니다. 인장 디쉬를 준비하려면 4인치 x 4인치 크기의 실리콘 막 조각을 O-링과 디쉬 사이에 고정하고, 초과하는 막 부분을 조심스럽게 잘라낸 뒤, 탈이온수로 인장 디쉬를 헹구고, 실리콘 막을 세포외 기질 분자로 코팅하기 전에 디쉬를 오토클레이브 처리하며, 막의 하단 중앙 외부 지점에 기준점을 표시합니다.

이 랜드마크는 단축 변형 적용을 위한 변형 실험 중에 동일한 세포를 식별하는 데 도움이 됩니다. 기준점 주변에 스카치테이프를 두 줄의 평행한 띠 형태로 붙여 막 형성이 한 방향으로만 이루어지도록 제한합니다. 최적의 세포 부착을 위해 실리콘 막을 3 µg/mL의 fibronectin 또는 적절한 세포외 기질 단백질로 코팅하십시오.

스트레인 디쉬를 뒤집은 10 centimeter 폴리스티렌 디쉬로 덮고, 다음 날까지 4 °C에서 하룻밤 동안 배양합니다. 과잉 단백질을 제거하기 위해 멤브레인을 PBS로 한 번 헹굽니다. 디쉬에 10 milliliters의 성장 배지를 채우고 따로 둡니다.

코팅된 실리콘 멤브레인 디쉬가 준비되면, 0.05% trypsin으로 세포를 처리하고 부착성 세포를 성장 배지가 담긴 디쉬에 파종합니다. 이 과정은 마우스 배아 세포를 사용하여 시연되었습니다.

섬유아세포 또는 중배엽 세포를 일반 배양 조건에서 24~48시간 동안 배양합니다. 기질 변형 실험용으로 갖춰진 도립 현미경에는 현미경 스테이지에 장착되는 베이스 플레이트로 구성된 변형 장치가 포함되어 있습니다. 이 플레이트는 실리콘 막의 중앙 부분에 변형을 가하는 역할을 하는 중앙 원통형 플래틴을 고정합니다.

이 장치에는 스트레인 디쉬(strain dish)를 고정하며 4개의 가이드 핀을 따라 위아래로 슬라이딩할 수 있는 가동 플레이트와, 하중을 가하기 위한 5파운드 무게추가 있습니다. 핵을 시각화하려면, 스트레인 디쉬 내의 세포를 1 µg/mL의 Hoechst 염색액과 함께 37 °C에서 15분 동안 배양하십시오. 배양 후, 배지를 흡입하여 제거하고 25 mM HEPES가 포함된 페놀 레드 프리(phenol red free) 성장 배지 15 mL로 교체하십시오.

그런 다음 디쉬를 디쉬 홀더에 나사로 고정하고, 실리콘 막이 중앙 플라틴(Platin)을 따라 부드럽게 미끄러질 수 있도록 실리콘 막 바닥의 둘레에 그리스를 조심스럽게 바릅니다. 이때 막의 중앙 부분에는 그리스가 묻지 않도록 주의하십시오. 베이스 플레이트를 현미경 스테이지 플레이트 위에 놓은 후, 디쉬 홀더를 베이스 플레이트에 조심스럽게 장착합니다.

초기 휴지 상태에서 스트레인 디시(strain dish)의 실리콘 막이 중앙 플래티넘(platin) 위에 가볍게 놓여 있는지 확인하십시오. 다음으로, 실리콘 막의 바닥면에 초점을 맞추어 중앙의 검은색 기준점을 찾으십시오. 이 점은 모든 이미지 획득의 시작점이 되며, 신장 중 및 신장 후 동일한 세포를 찾는 데 도움을 줍니다.

이 이미지에서 중앙의 점이 시야 전체를 채우고 있습니다. 점의 경계부터 시작하여 초점을 조절해 세포와 실리콘 멤브레인의 상단을 시각화하십시오. 핵이 중앙에 위치하고 잘 퍼져 있는 세포를 찾으십시오.

세포 윤곽과 실리콘 막에 초점을 맞춘 위상차 이미지를 획득합니다. 그다음 핵의 중앙 평면에 초점을 맞추어 핵 훅(nuclear hook) 염색의 형광 이미지를 획득합니다. 5개에서 15개의 세포 이미지를 획득한 후, 다시 중앙 점으로 이동합니다.

균일한 변형률이 적용되도록 스트레인 디시에 하중을 천천히 가합니다. 디시의 중앙 부분에 적용하십시오. 최대 기질 변형률은 수직 정렬 핀에 배치된 나일론 스페이서에 의해 제한됩니다. 변형률 적용 후, 실리콘 막의 바닥면에 초점을 맞추고 기준점을 다시 찾은 뒤, 해당 점에서부터 시작하십시오.

동일한 세포로 이동하여 다시 한번, 전체 변형 상태의 핵 내 각 세포에 대해 위상차 및 형광 이미지를 획득하되, 초기 이미지의 초점 평면과 최대한 일치하도록 합니다. 세포가 낯선 기질에 대해 능동적으로 리모델링 및 적응하는 것을 방지하기 위해 이 과정은 10분 이내에 완료되어야 합니다. 모든 해당 이미지를 획득한 후, 현미경 스테이지를 시작점으로 되돌립니다.

디시 홀더 플레이트에서 추를 조심스럽게 제거하고, 필요한 경우 실리콘 막이 이완되도록 합니다. 스트레인 디시를 초기 위치에 올 때까지 부드럽게 밀어 올립니다. 그런 다음 위상차 및 형광 이미지를 획득합니다.

스트레인 인가 후 세포의 이미지는 스트레인 이미지에 대해 설명한 것과 동일한 방식으로 획득하며, 스트레인 인가 전, 중, 후의 세포 및 형광 표지된 핵의 이미지를 분석하여 정규화된 핵 스트레인을 계산합니다. 본 시연에서는 분석을 위해 직접 작성한 MATLAB 스크립트를 사용하지만, 수동으로 기질 스트레인을 계산하기 위한 여러 대안적 옵션도 가능합니다. 대응하는 스트레인 인가 전 이미지와 인가 후 이미지 사이의 세포막 상에 위치한 3~6개의 대조점 위치를 매칭합니다. 그 후 MATLAB 프로그램은 스트레인 인가 전 이미지와 풀 스트레인 이미지 간의 매칭된 대조점 위치를 비교하여 인가된 막 스트레인을 계산합니다.

또한 사전 변형 이미지와 사후 변형 이미지 사이의 잔류 변형률(residual strain)에 대해 위치를 비교합니다. 제어점(control points)은 이미지 쌍을 정합하는 데 동시에 사용되며, 이는 손상되거나 탈락하는 세포를 감지하는 데 도움이 됩니다. 다음으로, 개별 핵마다 핵 변형률을 계산하는 별도의 MATLAB 프로그램을 사용하여 핵을 수동으로 선택합니다.

이는 전-변형(pre strain) 및 후-변형(post strain) 형광 이미지 간의 핵 크기를 맞추거나, 서로 다른 실험 간에 적용된 막 변형의 미세한 차이를 보정하기 위해 핵 내 마커를 맞춤으로써 달성됩니다. 결과는 정규화된 핵 변형으로 표시됩니다. 이는 각 핵에 대해 계산된 유도된 핵 변형과 적용된 막 변형의 비율로 정의됩니다.

MATLAB 스크립트는 요청 시 람빙(lambing) 연구실에서 제공받을 수 있습니다. 마지막 단계로, 각 핵을 검증하며 변형 적용 중 분리되거나 손상된 세포의 측정값은 제외합니다. 실리콘 막의 두 가지 서로 다른 영역에 퍼진 MEF를 여기에서 보여주는 20%UNI 축 방향 변형 적용 전, 중, 후에 위상차 및 형광 현미경으로 촬영하였으며, 이는 손상이나 분리 없이 변형 적용에서 살아남은 세포의 유효한 핵이 포함된 성공적인 실험 사례입니다.

이와 대조적으로, 여기에 표시된 세포들은 변형 적용 중에 수축하거나 부분적으로 탈착되었으며 분석에서 제외되었습니다. 왼쪽의 세포는 세포골격 손상과 핵 붕괴 징후를 보이며, 오른쪽의 세포는 변형 적용 중에 부분적으로 탈착되고 수축합니다. 이는 과도한 변형의 지표가 될 수 있습니다.

여기 Lamin A/C 결핍 마우스의 다양한 meth 세포주 패널에서 정규화된 핵 변형(normalized nuclear strain)을 분석한 결과가 제시되어 있으며, 이 세포들은 공벡터(empty vector) 또는 야생형 lamin A를 이소성으로 발현하며, 이를 야생형 리터메이트의 meth와 비교하였습니다. 핵막 단백질인 Lamin A/C의 발현 소실은 정규화된 핵 변형의 증가를 초래합니다. 이는 핵 강성(nuclear stiffness)의 감소를 나타내며, 야생형 Lamin A를 재도입함으로써 부분적으로 또는 완전히 회복될 수 있습니다. 마이크로니들 조작 실험을 준비하려면, 35mm 글라스 바텀 세포 배양 접시를 저농도의 fibronectin으로 37°C에서 2시간 동안 배양하십시오. 배양 후, 접시를 HBSS로 두 번 세척하고 2mL의 성장 배지를 접시에 추가하십시오.

그런 다음 마우스 배아 섬유아세포를 0.05% trypsin으로 처리하여 유리 바닥 디시에 fibronectin을 코팅한 후, 2 mL의 성장 배지와 함께 분주합니다. 단일 부착성 비합류 세포를 얻기 위해 세포를 인큐베이터에 넣고 하룻밤 동안 배양합니다. 세포 염색을 위해 성장 배지에 MitoTracker 미토콘드리아 염색약과 Hoechst 핵 염색약을 첨가합니다. 이 성장 배지를 세포에 추가하고 인큐베이션을 진행합니다.

다음으로, 상온에서 5분 동안 hank's buffered salt saline로 세포를 배양하여 세척합니다. 그 후, 이미징을 위해 25 millimolar HEPES가 포함된 phenol red free 성장 배지를 세포에 첨가합니다.

마이크로니들 실험을 위해, 이전에 제작된 마이크로니들을 디지털 전하결합소자(CCD) 카메라가 장착된 도립 현미경과 연결된 마이크로 매니퓰레이터에 삽입하십시오. 마이크로니들을 단일 세포 근처에서 카메라 및 초점을 맞춥니다. 마이크로니들을 세포골격에 삽입하기 전의 단일 세포 이미지를 한 장 획득하십시오.

위상차 이미지, hooks 3 3, 3 4 2 염색의 형광 이미지 1장, 그리고 미토콘드리아 염색의 형광 이미지 1장을 도립 현미경의 60 x 대물렌즈와 마이크로 조작기를 사용하여 촬영합니다. 마이크로 조작기를 이용해 마이크로니들을 핵 주변부에서 일정 거리 떨어진 세포질 내로 조심스럽게 삽입한 후, 위상차 이미지 1장, hooks 3 3, 3 4, 2 염색의 형광 이미지 1장, 그리고 미토콘드리아 염색의 형광 이미지 1장을 촬영합니다. 컴퓨터 제어 마이크로 조작기를 사용하여 마이크로니들을 초당 1 µm의 속도로 세포 주변부를 향해 특정 거리만큼 이동시키면서, 10초마다 자동으로 이미지를 획득합니다.

마이크로니들이 세포 주변부의 특정 거리까지 이동함에 따라, 일관된 마이크로 조작을 달성하기 위해 컴퓨터를 통해 마이크로 매니퓰레이터를 제어해야 합니다. 마이크로니들을 제거한 후 최종적으로 이미지를 획득하며, 마이크로니들 조작 전, 중, 후에 획득한 핵과 세포골격의 형광 표지 특징 이미지들을 분석하여 작은 세포 내 영역의 변위를 계산합니다. 본 시연에서는 분석을 위해 직접 작성한 MATLAB 스크립트를 사용하지만, 다른 여러 가지 옵션도 선택 가능합니다.

마이크로니들에 의해 생성된 변위를 측정하기 위한 MATLAB 스크립트는 Lambing 연구실에 요청하여 제공받을 수 있습니다. 이 MATLAB 프로그램은 정규화된 상호 상관 알고리즘(normalized cross correlation algorithm)을 사용하여 형광 표지된 특징점의 원래 위치와 새로 식별된 위치 사이의 이동량을 계산합니다. 이후 변위는 벡터 맵으로 표시되고 수치 값으로 저장됩니다.

다음 단계는 결과로 얻은 변위 벡터 맵을 사용하여 matlab으로 세포골격 또는 핵 내의 평균 변위를 결정하는 것입니다. 먼저, 변형 적용 부위의 세포골격 내에서 3개 이상의 지점을 선택합니다. 변위 벡터 맵에서 평균 수치를 산출하여 마이크로니들 적용 중에 발생한 적용 부위 주변의 세포골격 변형량을 결정합니다.

다음으로, 변형 적용 지점 근처의 핵 내부에서 3개 이상의 지점을 선택하여 평균값을 구합니다. 이 값은 마이크로니들 적용 지점 근처의 핵 변형량을 나타냅니다. 동일한 방법으로, 각각의 해당 영역에서 선택한 지점들을 통해 변형 적용 지점에서 떨어진 핵 및 세포골격의 변형도를 측정합니다.

세포 내 힘 전달을 측정하기 위해 마이크로니들 조작 분석을 수행했습니다. 여기에는 파란색 핵 염색약과 MIT tracker green 미토콘드리아 염색약으로 표지된 섬유아세포의 위상차 이미지와 형광 이미지가 나타나 있습니다. 마이크로니들을 핵으로부터 일정 거리 떨어진 세포골격에 삽입한 후, 세포 주변부 방향으로 이동시켰습니다.

세포골격 변형 전, 도중 및 후에 미토콘드리아의 변위를 추적하고, 해당 변위를 벡터로 표시하였습니다. 각 벡터는 원래 위치와 새롭게 확인된 위치 사이의 이동 거리로 계산된 변위를 나타냅니다. 이미지 강도가 낮거나 텍스처가 불충분한 영역은 분석에서 제외되었습니다.

그 후, 대조군 섬유아세포와 섬유아세포 모두에서 변형 적용 지점으로부터 거리가 멀어짐에 따라 선택된 영역에서의 세포골격 및 핵 변위를 정량화하였습니다. 핵-세포골격 결합이 유지된 세포에서는 결합력이 세포 전체로 전달되어, 변형 적용 지점에서 멀어질수록 서서히 소멸하는 핵 및 세포골격 변형이 유도됩니다. 이와 대조적으로, 핵-세포골격 결합이 파괴된 세포는 적용 지점 근처에서 국소적인 변위를 보이며, 그보다 먼 곳에서는 유도된 변형이 거의 나타나지 않습니다.

대조군 섬유아세포와 핵-세포골격 결합이 파괴된 섬유아세포 모두에서 마이크로니들 삽입 부위의 유사한 세포골격 변형 적용이 관찰되었습니다. 하지만, 다른 영역에서 유도된 핵 및 세포골격 변위는 핵-세포골격 결합이 파괴된 섬유아세포에서 대조군 세포보다 유의미하게 더 작았습니다. 따라서 변형 적용 부위에서 떨어진 곳의 세포골격 및 핵 변위 감소는 세포골격과 핵 사이의 강제 전달이 방해받았음을 나타냅니다.

이 영상을 시청한 후에는 핵의 역학 및 핵과 세포골격 사이의 세포 내 힘 전달을 측정하는 방법에 대해 충분히 이해하게 될 것입니다. 이러한 기술을 사용하여 핵막 단백질의 돌연변이 효과나 발달 과정 또는 암 발생 중에 나타나는 핵막 조성의 변화를 연구할 수 있습니다.