단클론 항체 정제를 위한 친화성 크로마토그래피 기법

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Immunology

0 조회수 • 3:03 분 • July 8th, 2025

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항체 결합 단백질인 단백질 A에 접합된 아가로스 비드가 포함된 친화성 크로마토그래피 컬럼을 가져 와십시오.

컬럼을 평형화하기 위해 중성 pH의 결합 완충액을 추가합니다.

단클론 항체 및 오염 세포 단백질을 포함하는 항체 생성 세포 배양에서 배양 상청액을 로드합니다.

중성 pH는 오염 물질이 흐르는 동안 단백질 A가 항체의 Fc 영역에 결합하는 것을 촉진합니다.

크로마토그램을 생성하기 위해 흐름의 UV 흡광도를 측정합니다. 시료 로딩 중 흡광도가 높으면 유동 중인 단백질이 결합되지 않았음을 나타냅니다.

결합 완충액으로 컬럼을 세척하여 비특이적으로 결합된 오염 물질을 제거합니다.

단백질 A-항체 상호작용을 방해하기 위해 낮은 pH의 용출 완충액을 첨가합니다. 흡광도의 피크를 모니터링하여 용출된 항체를 수집합니다.

pH를 중화하여 항체 분해를 방지하고 원심 필터로 옮깁니다.

원심분리하여 항체를 농축하고 다운스트림 분석을 위해 완충액에 재현탁합니다.

텍스트 프로토콜에 따라 버퍼를 준비하고 FPLC 시스템을 초기화한 후 메서드 편집기를 사용하여 다음과 같이 실행 단계를 설정합니다. 5개의 컬럼 부피 또는 결합 완충액의 CV로 시스템을 평형화합니다.

샘플을 컬럼에 로드하고 샘플 흐름을 수집한 다음 5CV의 결합 완충액을 사용하여 시스템을 세척합니다. 5 CV의 용출 완충액을 사용하여 등용매 분획을 통해 컬럼을 용리합니다. 정제된 항체 시료를 분획 수집기를 이용하여 분획으로 수집한다.

마지막으로, 5CV의 결합 완충액으로 시스템을 평형화하고 유량을 폐기물 용기로 수집합니다. 분석법 설정이 완료되면 컬럼에 적용할 컨디셔닝된 배지의 부피를 지정하고 분석법을 저장합니다.

다음으로, 샘플 펌프 튜브를 컨디셔닝된 매체가 들어 있는 용기에 담그십시오. 그런 다음 지정된 출구 튜브를 통해 샘플 흐름을 수집할 별도의 용기를 준비합니다. 분획 수집기에 수집 튜브를 삽입하고 각 수집 튜브에 중화 완충액을 추가합니다. 소프트웨어의 시스템 제어 모듈에서 사용할 방법을 엽니다. 그런 다음 시작을 클릭하여 실행을 시작합니다.

정제가 완료되고 평가 모듈이 완료되면 결과 크로마토그램을 확인합니다. 모든 단백질 함유 분획을 튜브에 결합한 다음 PBS와 30킬로달톤 컷오프가 있는 원심 필터 장치를 사용하여 샘플을 농축하고 완충액 교환을 수행합니다. 마지막으로 BCA 분석을 사용하여 제조업체의 지침에 따라 항체 농도를 측정합니다.

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마지막 업데이트: 22 8월 2026