Microtiter 플레이트 형식의 맛을 희석하여 첫 번째와 두 번째 라인 의약품 Mycobacterium 결핵의 복합 항균 자화율 테스트

결핵균(mycobacterium tuberculosis)을 치료하는 데 사용할 수 있는 약물이 상대적으로 적기 때문에, 어떠한 약물에 대해서라도 내성이 생기는 것은 우려되는 문제입니다. 본 비디오 논문은 12가지의 서로 다른 미생물 약물에 대해 M tuberculosis의 항생제 내성을 동시에 테스트하는 절차를 설명합니다. 따라서 M tuberculosis의 항생제 내성을 신속하게 검출하는 능력은 내성 균주의 증가를 억제하려는 노력에 있어 매우 중요하며, 본 연구에서는 항생제 감수성을 테스트하고자 합니다.

M tuberculosis를 먼저 고체 또는 액체 배지에서 배양하여 세균 현탁액을 만듭니다. 준비된 접종물을 1차 및 2차 약제를 포함한 12가지 약물이 다양한 농도로 들어 있는 마이크로타이터 플레이트에 첨가합니다. 배양 후, 각 웰의 성장 정도를 미러 박스를 이용하여 수동으로 측정하거나 반자동 플레이트 리더를 사용하여 결정합니다.

결과 데이터는 테스트한 각 약물의 최소 억제 농도를 나타내며, 테스트한 TB 균주가 어떤 항생제에 내성이 있는지 보여줍니다. 이러한 결과는 tb 치료를 위한 적절한 약물을 선택하는 데 도움이 됩니다. 안녕하세요, 저는 미네소타주 로체스터에 있는 Mayo Clinic의 Myco Bacteriology Laboratory 책임자인 Nancy Ek입니다.

오늘은 결핵균(mycobacterium tuberculosis)의 항생제 감수성 테스트 방법에 대해 설명하겠습니다. 거대 액체 배지 희석법(macro broth dilution)과 같은 기존 방법과 비교했을 때 이 기술의 주요 장점은 각 약물에 대한 최소 억제 농도(MIC)를 결정할 수 있으며, 12가지 항생제를 동시에 테스트할 수 있다는 점입니다. 실험실 벤치에서 작업을 수행하며 절차를 시연할 사람은 저희 실험실의 품질 전문가인 Kurt Jude입니다.

혈액 배지 플레이트 1개, Middlebrooks 7H10 배지 플레이트 3개, saline tween 유리 구슬 튜브 1개, 그리고 마이크로타이터 플레이트에 환자 성명과 검체 식별 번호를 기입하여 본 절차를 준비합니다. 추가로, 혈액 배지와 7H10 배지 플레이트에는 '순수 배양(purity)'이라고 표시합니다. 이 중 7H10 배지 플레이트 하나에는 '1:1 군락 수(1 to 1 colony count)', 다른 하나에는 '1:50 군락 수(1 to 50 colony count)'라고 표시하십시오.

그 다음 트레이를 패스스루(pass through)에 넣습니다. 다음으로, 전면 폐쇄형 가운, 헤드 커버, 장갑, 신발 커버 및 호흡기 보호구를 착용하여 생물안전 3등급 BSL 3 시설에서 작업할 준비를 합니다. 여기서는 PAPR 호흡기 보호구가 사용됩니다.

그런 다음 패스스루에서 트레이를 꺼냅니다. 다음으로 BSL 3 시설 내에서 생물안전작업대의 표면을 소독합니다. 그런 다음 소독제에 적신 종이 타월을 후드 내부의 공기 배출 패널에서 약 6인치 떨어진 곳에 놓습니다.

접종 루프, 피펫과 팁, 적절한 폐기물 처리 용기, nephi, TER 및 볼텍스를 준비합니다. 후드 준비가 완료되면, McFarland 0.5 표준액, OADC가 포함된 7H9 배지 및 생리식염수 비드 튜브가 담긴 랙과 함께 균주를 페이퍼 타월 위에 놓습니다. 이 설정은 고체 배지로부터 수행됩니다.

환자 검체에서 유래한 고체 배지 배양물로부터 접종원을 준비합니다. 멸균 루프를 사용하여 콜로니를 긁어내어 saline tween 유리 구슬 튜브로 옮깁니다. 현탁액을 30~60초 동안 볼텍싱합니다.

시료를 육안으로 검사하여 McFarland 표준액과 비교합니다. 옮겨진 양이 표준액과 같거나 더 많아야 합니다. 그렇지 않은 경우, 박테리아 시료를 더 추가하고 다시 볼텍싱합니다.

McFarland 표준과 일치시킨 후, 박테리아의 큰 덩어리들이 가라앉을 수 있도록 접종물을 15분 동안 방치합니다. 다음으로, nefi TER를 사용하여 현탁된 박테리아의 밀도를 0으로 측정합니다. nephi ter.

먼저 빈 식염수 비드 튜브를 네피로미터(nephilometer)에 넣습니다. 보정 버튼을 눌러 기기를 영점 조절한 후, 0.5 McFarland 표준액을 네피로미터에 넣고 보정 버튼을 다시 누릅니다. 기기 보정이 완료되면 McFarland 표준액을 제거하고 접종액을 삽입합니다.

접종액의 측정값은 McFarland 표준 측정값과 일치해야 합니다. 측정값이 너무 낮으면 튜브를 꺼내 플레이트에서 박테리아를 더 옮깁니다. 그런 다음 볼텍싱하고 샘플을 다시 측정합니다.

측정값이 너무 높으면, 튜브에 saline tween을 추가하고 볼텍싱합니다. 그 후 샘플을 다시 측정하십시오. 박테리아 농도가 McFarland 표준과 일치할 때까지 필요에 따라 접종량을 계속 조정하십시오.

다음으로, 200 µL 피펫과 길이 연장형 에어로졸 방지 피펫 팁을 사용하여 튜브 상단 1/3 지점에서 접종액 100 µL를 취합니다. Middlebrook 7H9 배지의 바닥에 가라앉은 덩어리가 섞이지 않도록 하기 위해, 접종된 배지를 20초 동안 천천히 볼텍싱하여 접종액을 도말합니다. 먼저 제조사 패키지에서 마이크로타이터 플레이트를 꺼냅니다. 제습제가 파란색이 아니거나 알루미늄 호일 패키지가 손상된 경우 사용하지 마십시오.

플레이트의 각 웰에는 가장 효과적인 1차 선택 약제와 2차 선택 약제를 포함하여 테스트할 12가지 항균제가 이미 들어 있습니다. 에어로졸이 발생하지 않도록 주의하며 7H9 broth 접종액을 튜브에 조심스럽게 붓습니다. 그런 다음 여기 보이는 것처럼 라벨이 바깥쪽을 향하도록 마이크로 타이터 플레이트를 놓고, 12채널 피펫을 사용하여 각 웰에 접종액 100 µL를 추가합니다.

다음으로, 콜로니 수를 측정하기 위한 플레이트를 준비합니다. 먼저, 양성 대조군 웰에서 샘플 1 µL를 루프로 취해 '1 to 1'로 표시된 7 H 10 플레이트에 옮겨 희석하지 않은 플레이트를 준비합니다. 그런 다음, 여기에 표시된 대로 루프를 사용하여 플레이트에 스트리킹합니다.

다음으로, 1:50 희석액을 준비하기 위해, 양성 대조군 웰에서 1 µL 루프를 사용하여 시료를 취한 후 50 µL의 멸균수가 들어 있는 튜브에 넣고 섞어줍니다. 이 희석액 1 µL를 1:50으로 표시된 플레이트에 도말합니다. TSB 배지에서 접종액 50 µL를 피펫으로 취해 적절하게 라벨링된 혈액 한천 배지와 7H10 배지에 분주한 후, 순수 배양을 위해 분리 도말합니다.

그 다음 접종된 trth 위에 또 다른 trth를 쌓고 이를 폐기물 용기에 조심스럽게 넣습니다. 마이크로타이터 플레이트에 접착 씰을 붙입니다. 그 후 흰색 뒷면을 이용하여 각 웰을 단단히 눌러 주름이 생기지 않도록 완전히 밀봉되었는지 확인합니다.

결핵균 살균 소독제로 적신 페이퍼 타월로 마이크로타이터 플레이트를 닦아 소독합니다. 그다음 마이크로타이터 플레이트를 플라스틱 백에 넣고 열 밀봉기로 밀봉합니다. 마지막으로 네피, 필터 볼텍스, 플레이트 및 튜브를 포함한 모든 재료를 결핵균 살균 소독제로 닦아 소독합니다.

소독이 확실히 이루어질 수 있도록 충분한 시간이 지난 후 pro spray를 사용합니다. pro spray의 경우 15분간 처리합니다. 플레이트는 스카치테이프로 테이핑하여 플라스틱 백에 넣고, 밀봉된 소모품들은 생물안전작업대에서 꺼내 패스스루(pass through)로 옮깁니다.

폐기용 빨간색 봉투를 닫고 트위스트 타이로 밀봉한 후, 가운, 신발 덮개 및 장갑을 벗습니다. 전실로 이동하여 손을 씻은 다음, 호흡기 보호구를 제거하고 다시 손을 씻은 후 호흡기 보호구를 소독하여 보관합니다. 그리고 새 가운을 입고 BSL 3 구역을 나옵니다. 다음으로, 폐기물 용기를 오토클레이브로 멸균합니다.

이후, BSL 2 실험실 내 35~37 °C, 5~10% CO2 인큐베이터에서 마이크로타이터 플레이트와 7개 H 10 및 blood auger 플레이트를 똑바로 세워 배양합니다. 플레이트가 밀봉되어 비닐 봉투에 들어 있으므로 이 방법이 허용됩니다. Mycobacterium tuberculosis의 세대 시간은 약 12~24시간이므로, 대조군 웰 바닥에 세포 펠릿이 형성되어 성장이 관찰되기까지 최소 일주일이 소요됩니다. 10일째 되는 날, 밀봉된 AST 마이크로타이터 플레이트를 미러 박스 플랫폼 위에 올려 수동으로 mirror read를 수행합니다.

성장 여부를 시각적으로 확인하기 위해 데스크 램프를 사용하고, 최적의 대비가 나타나도록 필요에 따라 조절하십시오. 거울을 통해 성장 대조군 웰(이 경우 H 11 및 H 12)을 확인하십시오. 성장이 일어난 경우, 여기에서 보는 것과 같이 웰이 혼탁해지거나 침전물이 있는 것처럼 보입니다.

이 예시와 같이 성장이 없는 경우, 웰은 투명하게 보일 것입니다. 이 경우, 플레이트를 다시 배양기에 넣고 최대 21일까지 배양을 계속하십시오. 각 조건에 대해 대조군과 성장을 비교하십시오.

그 다음, 각 약물 기록에 대해 성장이 나타나지 않는 첫 번째 희석 배수를 확인합니다. 이것이 해당 약물의 최소 억제 농도(minimal inhibitory concentration) 또는 MIC가 됩니다. VisiOn과 같은 자동 플레이트 리더를 사용하여 결과를 분석하려면, 먼저 Myco TB AST 플레이트 소프트웨어를 실행하고 로그인하십시오. 바코드가 바깥쪽을 향하도록 밀봉된 플레이트를 배치합니다. 여기에서 보는 바와 같이, 성장은 컴퓨터 화면상에서 탁도로 나타나거나 웰 바닥에 세포가 침전된 형태로 나타납니다.

먼저, 성장 대조군을 확인하십시오. 이전과 동일하게 진행합니다. 만약 성장이 나타나지 않은 음성 결과라면, 플레이트를 인큐베이터에 다시 넣고 최대 21일 동안 배양하십시오.

결과가 양성인 경우, 각 약물에 대해 성장이 나타나지 않는 첫 번째 웰을 화면에서 터치하여 결과를 기록하십시오. 일부 경우에는 박테리아, 침전물 또는 약물이 웰 바닥으로 가라앉을 수 있습니다. '트레일링(trailing)'이라고 알려진 이 현상은 동일한 크기의 펠릿이 여러 웰에서 나타나는 것으로 확인되며, 이는 실제 양성 성장으로 간주되지 않습니다.

다음으로, 7개의 H 10 및 혈액 한천 배지를 검사하여 세균 농도를 결정하고 순도를 평가합니다. 혈액 한천 배지에서는 48시간 후에 성장이 관찰되지 않아야 합니다. 혈액 한천 배지에서 성장이 나타나면 빠르게 성장하는 세균에 의해 오염되었음을 의미합니다.

성장이 확인되면 마이크로타이터 시험을 반복해야 합니다. 7 H 10 순도 플레이트에는 한 종류의 미생물만 성장해야 합니다. Type EM tuberculosis는 황갈색을 띠며 주름지고 거친 표면으로 나타나야 합니다. 오염된 경우, 순수 배양물로부터 마이크로타이터 시험을 다시 수행해야 합니다.

박테리아 농도를 평가하려면 7 H 10 플레이트의 콜로니 수를 측정하십시오. 그 다음, 동봉된 서면 문서의 표를 사용하여 콜로니 수를 계산하십시오. 환자 검체로부터 Mycobacterium tuberculosis를 배양하였으며, 이 비디오에서 설명한 대로 항생제 내성을 평가했습니다. 여기에 표시된 플레이트에는 12가지의 서로 다른 약물이 농도별로 배치되어 있으며, 상단이 가장 높은 농도이고 하단이 가장 낮은 농도입니다.

약물의 최소 억제 농도(MIC)는 성장이 나타나지 않은 가장 낮은 약물 농도로 정의되며, 여기 표시된 이미지에서 Clinical and Laboratory Standards Institute(CLSI)가 설정한 표준 분절점(breakpoints)을 사용하여 원으로 표시하였습니다. 여기에 제시된 데이터는 이 결핵균 균주가 Isid 및 Rifampin에 내성을 가질 것임을 시사합니다. In vitro 실험에서 oin, moxifloxacin, streptomycin, rifabutin을 포함한 여러 다른 약물에서 관찰된 높은 MIC 값은 EM 결핵 균주가 이러한 약제들에 대해 내성을 가지고 있음을 시사합니다.

MIC 결과는 결핵 치료 경험이 풍부한 감염내과 전문의가 개별 맞춤형 치료 계획을 수립하는 데 활용해야 합니다. 이 기술을 숙달하면 분리균 한 개당 준비하는 데 약 40분이 소요됩니다. 본 절차를 수행할 때, 이는 호흡기 병원균이며 에어로졸이 발생할 수 있음을 유념하는 것이 중요합니다. 이 영상을 시청한 후에는 미량 액체 희석법(micro broth dilution method)을 이용한 mycobacterium tuberculosis의 항균제 감수성 시험 준비 방법을 충분히 이해하게 될 것입니다. mycobacterium tuberculosis를 다루는 것은 매우 위험할 수 있으므로, 필요한 경우 호흡기 보호와 같은 예방 조치를 항상 취해야 함을 잊지 마십시오.