CRISPR-Cas9 시스템을 사용한 CAR T 세포의 유전자 변형

JoVE Encyclopedia of Experiments

Immunology

0 조회수 • 2:55 분 • July 8th, 2025

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T 세포의 현탁액으로 시작하여 키메라 항원 수용체 또는 CAR 및 CRISPR 렌티바이러스에 대한 유전자를 운반하는 CAR 렌티바이러스로 치료합니다.

CRISPR 렌티바이러스에는 가이드 RNA 및 Cas9 뉴클레아제에 대한 유전자와 항생제 내성 유전자가 포함되어 있습니다.

CAR 및 CRISPR 렌티바이러스는 모두 T 세포와 상호 작용하여 RNA를 방출합니다.

이 RNA는 역전사되어 해당 DNA로 변환되어 T 세포 DNA에 통합됩니다.

이를 통해 CAR 단백질, 가이드 RNA 및 Cas9 단백질의 합성이 가능합니다.

가이드 RNA는 Cas9와 복합체를 형성하여 T 세포 DNA의 표적 유전자를 특이적으로 인식하고 결합합니다.

한편 Cas9은 DNA를 절단하여 이중 가닥 절단을 생성합니다.

이 절단은 오류가 발생하기 쉬운 복구 메커니즘인 비상동 말단 결합을 통해 복구되어 표적 유전자 변형을 초래합니다.

이것은 키메라 항원 수용체를 가진 유전자 변형 T 세포를 생성합니다.

세포를 항생제로 처리하여 변형되지 않은 T 세포를 제거하고 유전자 변형 CAR T 세포를 선택적으로 분리합니다.

과립구-대식세포 콜로니 자극 인자를 파괴하려면 원고에 설명된 대로 가이드 RNA를 활용하십시오. 형질감염 시약을 실온에서 30분 동안 배양합니다. 배양 후, 70% 내지 90% 컨플루션에 도달한 293T 세포에 첨가하고, 형질감염된 세포를 섭씨 37도, 5% CO2에서 배양하여 렌티바이러스를 생산한다.

24시간 및 48시간에 바이러스 함유 상청액을 수확하여 50밀리리터 초원심분리기 튜브에 초원심분리하여 농축하고 향후 사용을 위해 섭씨 영하 80도에서 동결합니다. 그런 다음 첫날에 T 세포를 부드럽게 재현탁하여 로제트를 분해합니다.

BSL-2 plus 승인된 실험실에서 CAR T 세포를 생성하려면 자극된 T 세포에 CAR19 렌티바이러스 및 GM-CSF 표적 CRISPR 렌티바이러스를 추가합니다. 3일차와 5일차에 성공적으로 형질도입된 퓨로마이신 내성을 지닌 렌티-CRISPR 편집 T 세포의 경우, 밀리리터당 1마이크로그램의 퓨로마이신 농도의 퓨로마이신 디염산염으로 세포를 처리합니다.

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마지막 업데이트: 22 8월 2026