레이저 스캐닝 Photostimulation에 의해 억제 Neuronal 회로를 매핑

이 실험 절차의 전체적인 목표는 억제성 신경 회로의 국소적 기능 조직을 조사하는 것입니다. 먼저 마우스의 일차 체성감각 피질에서 살아있는 뇌 절편을 준비합니다. 그다음 단계는 뇌 절편 내에서 표적이 되는 GFP 발현 억제성 세포 유형을 시각화하고 기록하는 것입니다.

글루타메이트를 통한 이러한 레이저 스캐닝 광자극 이후, 언케이지ング(uncaging)을 사용하여 소규모의 시냅스 전 뉴런 집단을 흥분성 또는 억제성으로 활성화합니다. GFP를 발현하는 중간 뉴런에서 시냅스 후 전류를 기록합니다. 마지막 단계는 광자극과 데이터 분석을 거쳐, 기록된 뉴런에 대한 시냅스 입력의 정량적 지도를 생성하는 것입니다.

궁극적으로, 전체 세포 기록법(whole cell recordings)과 결합된 레이저 스캔 광자극은 특정 유형의 억제성 뉴런으로 들어오는 시냅스 입력의 상세한 지도를 작성할 수 있게 하며, 이를 통해 국소 억제성 피질 회로의 조직과 기능을 결정할 수 있습니다. 광자극 기반 기술은 Larry Katz 박사와 Ned Calloway 박사에 의해 개척되었으며, 이후 저의 지도교수인 Carols Waboda 박사와 Salk 연구소의 Calloway 박사로부터 교육받아 신경 회로를 조사하는 많은 연구를 이끈 Xing Z 박사에 의해 더욱 발전되었습니다. 저희 연구 그룹은 현재 이러한 연구를 확장하고 지속하며 신경 회로를 조사하고 있습니다.

이 절차를 시작하려면, 생후 2~3주 된 형질전환 마우스를 경추 탈골로 희생시키고 뇌를 빠르게 적출하여, 냉각 및 산소 공급이 된 절편 제작 용액에 넣으십시오. 그런 다음 GFP 고글을 사용하여 뇌를 시각적으로 스크리닝하고 GFP 발현 여부를 확인합니다. 다음으로, 진동 절편기를 사용하여 일차 체성감각 피질을 400 µm 두께의 절편으로 자릅니다.

95%O2와 5%CO2가 버블링된 sucrose 함유 A CSF에서 슬라이스를 32 °C로 30분에서 1시간 동안 배양합니다. 그 후, 슬라이스를 상온의 일반 A CSF로 옮기고, 실험을 위해 레이저를 준비하며 레이저 냉각 시스템과 전원 공급 장치를 켭니다. 이어서 스캐닝 미러 시스템, 광 변조기 및 전자 셔터, 포토다이오드 입력 증폭기를 포함하여 광자극 제어와 관련된 모든 하드웨어를 켭니다.

다음으로 Multi Clamp 700 B 증폭기와 마이크로 조작기(micro manipulator)와 같은 전기생리학 장비를 켭니다. 전기생리학적 기록, 광자극 및 이미징은 현미경의 전동 스테이지에 장착된 슬라이스 관류 챔버에서 수행됩니다. 그 후, 이미징 카메라를 켜면 이미징 시스템을 통해 적외선 DIC 및 에피 형광 광학계가 갖춰진 정립 현미경으로 슬라이스를 시각화할 수 있습니다.

그런 다음 모니터에서 MATLAB 기반 FS 소프트웨어와 Q capture 카메라 소프트웨어를 엽니다. 실험을 진행하기 전, 레이저 광자극 시스템을 점검하여 작동 상태인지 확인하십시오. 시스템이 작동하는 동안 레이저 스캐닝 패턴을 관찰할 수 있도록 4배 x 현미경 대물렌즈 아래에 종이 한 장을 놓습니다.

4~6 MΩ 저항의 미세 전극을 제작하려면, 파이펫 풀러를 사용하여 유리 전극을 당깁니다. 그 다음, 세포 라벨링 및 형태학적 식별을 위해 0.1% biotin이 포함된 내부 용액을 전극에 채웁니다. 이어서, 가압 관류 시스템을 켜서 챔버 내로 A CSF를 펌핑합니다.

챔버 내 슬라이스 위로 2.0 millimeters의 일정한 액체 높이를 유지하십시오. MNI caged glutamate 스톡 솔루션의 일정량을 25 milliliters의 순환 A CSF에 첨가하여 0.2 millimolar 농도의 caged glutamate 용액을 만듭니다. 그런 다음 뇌 슬라이스 하나를 기록 챔버로 옮깁니다.

이미징 시스템을 가동하여 슬라이스의 품질을 확인하고 일차 체성감각 영역의 해부학적 위치를 파악합니다. 다음으로, 맞춤 제작된 실 연결 플래티넘 링으로 슬라이스를 고정하되, 고정 장치가 기록 예정인 뇌 영역 위에 놓이지 않도록 주의하십시오. A DIC 형광 현미경 하에서 GFP 발현 시각화를 통해 60 x 대물렌즈로 세포를 관찰합니다.

억제성 세포 유형을 식별하고 선택하십시오. 기록은 적외선 DIC의 도움을 받는 시각적 제어 하에 수행된다는 점에 유의하십시오. 전극을 표적 세포로 내리는 동안 GFP 세포의 위치를 확인하기 위해 비디오 모니터링과 DIC 모드 및 형광 모드 간의 전환이 필요합니다.

전형적인 패치 클램프 기법을 사용합니다. 먼저 전극에 양압을 가합니다. 전극을 세포 표면에 가까이 이동시켜 표적 세포막에 식별 가능한 함몰(dimple)을 형성합니다.

그런 다음 빠르게 음압을 가해 기가 씰(giga seal)을 형성하고, 비디오 모니터로 전류 주입 반응을 모니터링하면서 세포막을 천공합니다. 천공 후, 온라인 검증을 위해 DIC 및 형광 모드에서 60배 배율로 GFP가 발현된 내부 뉴런의 이미지를 촬영합니다. 광자극 데이터를 수집하기 전, 과분극 및 탈분극 전류 펄스를 주입하여 각 세포의 기본적인 전기생리학적 특성을 조사합니다.

안정적인 상태에서 액세스 저항이 보통 20 mega ohms 미만인 양호한 전세포 기록(whole cell recording)이 달성되면, 레이저 스캐닝 광자극을 위해 현미경 대물렌즈를 60 x에서 4 x 배율로 전환하고, 4 x 배율에서 슬라이스 이미지를 획득하여 광자극 부위를 안내하고 등록하는 데 사용하십시오. phys의 구성 스위치 모듈을 활성화하여 광자극 및 데이터 획득 파라미터를 설정하십시오. 자극 간격은 1초로 하며, 약 20 milliwatts의 1 millisecond 레이저 펄스를 사용하십시오.

광자극 매핑을 위해, 10 kHz로 샘플링된 1초 분량의 데이터 트레이스를 획득합니다. 다음으로, 4x 슬라이스 이미지를 phys의 매퍼 모듈로 불러옵니다. 세포체(soma)의 위치를 정의하고, 80 µm x 80 µm 크기의 16 x 16 패턴으로 광자극 지점을 설정합니다.

모든 피질 층을 포함하는 세포 위치 주변의 간격을 설정합니다. 그런 다음, 전류 클램프 모드에서 광자극에 반응하여 나타나는 스파이킹 위치를 조사함으로써 기록된 뉴런의 흥분 프로파일을 매핑합니다. 온라인 디스플레이 기능을 갖춘 사용자 친화적인 소프트웨어는 이러한 매핑 실험을 용이하게 합니다.

그 후, 기록된 세포로부터 흥분성 postsynaptic 전류를 검출하여 국소 흥분성 회로 연결을 매핑합니다. 서로 다른 위치에서 레이저 스캐닝을 수행하며, 내향 흥분성 전류를 검출하기 위해 전압 클램프 모드에서 세포를 -70 mV로 유지합니다. 그런 다음 광자극 패턴을 회전시키거나 반전시켜 흥분성 postsynaptic 전류 매핑을 2~3회 반복합니다. 국소 억제성 회로 연결을 매핑하려면, 기록된 세포로부터 억제성 postsynaptic 전류를 검출합니다.

이 경우, 외향성 억제 전류를 검출하기 위해 전압 클램프 모드에서 세포의 전위를 0 mV에 가깝게, 즉 -15 mV로 유지하십시오. 모든 생리학적 분석을 완료한 후, 기록된 세포에서 전극을 조심스럽게 제거합니다. 뇌 절편을 챔버에서 꺼내 4% paraformaldehyde에 담가 하룻밤 동안 고정시킨 후, 기록된 세포를 biotin에 대해 염색하십시오.

본 실험에서는 GFP 발현, 내인성 전기생리학적 특성 및 형태학적 특성을 결합하여 억제성 뉴런을 분류합니다. 여기서는 레이저 스캐닝 광자극의 예시와 가공되지 않은 데이터 맵을 보여주며, 이를 통해 기록된 억제성 뉴런으로 연결되는 국소 피질 회로 연결의 광범위한 매핑이 가능합니다. 그림 D에서 보여준 원시 트레이스(raw traces)로부터 유도된 색상 코드 기반의 정량적 입력 맵 예시입니다. 기록된 중간 뉴런(inter neuron)에서 검출된 시냅스 이벤트의 진폭이 색상으로 코드화되어 광자극 위치 위에 지형학적으로 중첩되어 있습니다.

세포체의 위치는 스케일 바의 빨간색 빈 원으로 표시되어 있습니다. 따뜻한 색상은 강한 시냅스 입력을 나타내며, 차가운 색상은 표적 세포로의 연결성이 약하거나 없음을 나타냅니다. 마찬가지로, 그림 E는 기록된 뉴런에 대해 샘플링된 광해방 위치당 시냅스 이벤트의 수를 보여줍니다.

그림 F는 스케일 바 이후 광자극을 가했을 때, 기록된 세포에서 처음 감지된 시냅스 이벤트의 시작 시간을 보여줍니다. 따뜻한 색상은 짧은 입력 지연 시간을 나타내며, 차가운 색상은 더 긴 시냅스 지연 시간을 나타냅니다. 따라서 LSPS를 통해 특정 유형의 억제성 뉴런에 유입되는 입력의 위치, 강도, 지연 시간 및 입력 수에 대한 상세한 지도를 구축할 수 있습니다.

본 실험 절차를 수행할 때는 인내심을 갖고 깨끗한 실험 조건을 조성하는 것이 중요하며, 고배율에서 저배율로 변경할 때 뉴런이 손상되지 않도록 매우 주의해야 합니다. 마지막으로 분석 소프트웨어를 능숙하게 사용하십시오.