자동 와이어 Myography를 사용 Mesenteric 동맥 수축과 휴식 연구

본 절차에서는 doll 염 민감성 및 염 저항성 쥐를 사용하여 phenylephrine 인장 상태에서 장간막 저항 동맥의 세포 외 칼슘에 대한 반응성을 비교합니다. 이를 위해 먼저 동물로부터 장간막 아케이드(mesenteric arcade)를 분리하고 저항 동맥 분지들을 박리합니다. 다음으로, 두 개의 스테인리스 스틸 와이어 중 첫 번째 와이어를 박리된 동맥의 짧은 분절에 통과시킨 후 혈관을 그래프 챔버(graph chamber)에 장착합니다.

그 다음, 첫 번째 와이어와 평행하게 두 번째 스테인리스 스틸 와이어를 혈관 내강에 통과시킵니다. 이어서, 고정된 혈관을 표준 내부 원주 길이까지 늘립니다. 이 절차의 마지막 단계는 phenylephrine을 반복적으로 투여하여 혈관을 수축시키고, calcium을 누적 투여하여 이완시킴으로써 혈관의 반응성을 재활성화하는 것입니다.

최종적으로, 결과는 혈관 내 장력의 변화를 나타내며, 이는 칼슘 반응 곡선으로 변환하여 EC 50 값을 결정하는 데 사용할 수 있습니다. 비교를 위해, 우리는 쥐의 mesenteric arteries 신경망이 gpro copper 칼슘 감지 수용체를 발현한다는 것을 발견했을 때 처음으로 이 방법을 사용한다는 아이디어를 얻었습니다.

이는 작용제(agonist)에 의해 활성화되는 쓴맛 AIC 수용체와 동일한 방식으로 연구할 수 있습니다. 일반적으로 이 방법에 익숙하지 않은 개인의 경우, 내피 및 평활근 층이 얇기 때문에 어려움을 겪을 수 있습니다. 혈관이 쉽게 손상되기 때문입니다.

이러한 현상이 발생하면, 이들 혈관의 기계적 특성이 저하될 수 있습니다. 먼저, 작업 영역과 수술 기구를 준비하십시오. 마취된 동물을 등으로 눕히고 복부를 알코올로 닦아냅니다.

정중선 개복술을 시행한 후, 가위로 상장간막동맥을 포함하여 약 85 cm의 장을 절제합니다. 유문 근처의 근위단과 회맹접합부 근처의 원위단을 절단합니다. 절제한 분절을 실온의 생리식염수 또는 PSS가 담긴 코팅된 페트리 접시에 넣습니다.

창자의 근위단 끝을 오른쪽에 고정하고, 나머지 창자 부분을 시계 반대 방향으로 고정합니다. 그다음, 2번 및 3번 분지와 창자의 근위단 일부가 포함된 장간막 동맥 분절을 박리합니다. 장간막 동맥의 V자형 분기점을 확인하고 이를 정맥에서 박리합니다.

동맥과 직접 접촉하는 것을 방지하기 위해 포셉을 사용하여 지방 및 결합 조직을 조심스럽게 제거합니다. 혈관 장착을 시작하려면 약 2 mm 길이의 동맥 분절 두 개를 절단합니다. 동맥의 내강을 열기 위해 4 cm 길이의 40 µm 텅스텐 프리 스테인리스 스틸 와이어 끝부분을 사용할 수 있습니다.

그 다음, 미세 핀셋을 사용하여 각 동맥의 내강에 와이어를 삽입합니다. 내피세포가 손상되지 않도록 주의하며, 마이오 그라프트(myo graft) 챔버를 37 °C의 PSS로 채웁니다. 핀셋을 사용하여 와이어가 삽입된 혈관 분절을 챔버로 옮깁니다.

다음으로, 절제된 근위 혈관 분절을 마이오그래프 챔버로 옮기고, 와이어를 따라 끝부분을 당겨 혈관 내부로 삽입합니다. 이때 혈관이 늘어나지 않도록 주의하십시오. 와이어의 가까운 쪽 끝을 마이크로미터와 연결된 우측 조(jaw)의 근접 고정 나사 아래에 시계 반대 방향으로 고정합니다.

포셉으로 와이어의 자유단(free end)을 잡고 오른쪽 조(jaw)의 먼 쪽 고정 나사 아래로 시계 방향으로 고정하며, 이때 와이어를 따라 배치된 혈관 분절이 조 자체에 닿지 않고 조 사이의 틈에 위치하도록 합니다. 조를 서로 벌려 나사를 조입니다. 두 번째 와이어를 혈관과 평행하게 맞춘 후 루멘(lumen)의 먼 쪽 끝으로 삽입합니다.

이미 장착된 와이어를 가이드 삼아, 와이어를 혈관 분절의 내강을 통해 한 번의 동작으로 조심스럽게 밀어 넣습니다. 조작 중에 혈관이 늘어나는 것을 방지하고 내피세포를 건드리지 않도록, 혈관에서 약 1cm 떨어진 지점에서 와이어를 잡습니다. 조(jaw)를 조여 고정하고, 두 번째 장착 와이어가 오른쪽에 고정된 첫 번째 와이어 아래로 이동하는지 확인합니다.

트랜스듀서에 연결된 왼쪽 조(jaw)의 가까운 쪽 고정 나사 아래에 두 번째 와이어의 가까운 쪽 끝을 시계 방향으로 고정합니다. 와이어의 먼 쪽 끝을 왼쪽 조의 고정 나사 아래에 고정하고, 와이어가 팽팽해지도록 조입니다. 장착이 완료되면 37 °C에서 30분 동안 평형 상태가 되도록 둡니다.

평형 도달 후, 장착 메뉴에서 모터를 리셋하고 혈관을 표준 내부 둘레까지 확장하는 표준화 절차를 시작합니다. 먼저 표준화 메뉴를 열고 목표 transmembrane 압력을 13.3 kilopascals로 설정합니다. 다음으로, 각 표준화 단계의 지속 시간을 60 seconds로 설정합니다.

IC one 대 IC 100의 비율은 0.9여야 하며, IP 캘리브레이션은 two star delta로 설정해야 합니다. 혈관 세그먼트의 양 끝단에 헤어라인이 위치했을 때 현미경 접안렌즈의 읽기 값을 사용하여 장착된 장간막 동맥의 길이를 측정합니다. 정규화 후, 일련의 자극과 세척 기간으로 구성된 표준 시작 과정을 수행하여 혈관을 재활성화합니다.

먼저, 근육 챔버 덮개를 교체하고 95% air와 5% carbon dioxide로 폭기를 시작합니다. 100 micromolar ascorbic acid가 포함된 신선한 PSS로 챔버를 채웁니다. 5 micromolar phenylephrine, rine 또는 PE를 사용하여 혈관을 5분 동안 수축시킨 후, PSS 버퍼로 4회 세척합니다. 마지막 세척 후, 챔버를 PSS로 다시 채우고 3분간 대기한 다음, 다시 PSS로 채우고 PE로 수축시킵니다. 이전에 설명한 바와 같이, 이제 동맥이 실험 준비되었습니다.

염화칼슘의 농도를 점진적으로 높여 투여하여 수축된 혈관의 이완 정도를 측정합니다. 이 표는 페닐에프린 투여 후의 기저 장력이 Wistar DS(Doll 염분 민감성) 쥐와 DR(Doll 염분 저항성) 쥐 사이에서 서로 다르게 나타났음을 보여줍니다. Wistar 쥐의 이 추적 그래프는 점진적인 칼슘 투여에 따른 PE 수축 동맥의 이완을 보여주는데, Wistar 쥐나 여기서 보이는 DR 쥐와 비교했을 때 DS 쥐 유래 조직에서는 이완 능력이 심하게 저하되어 있습니다. 칼슘 민감도의 차이는 칼슘 반응 곡선과 EC 50 값 계산 결과에서 확인할 수 있습니다.

마지막으로, DS 쥐는 Dr.Rats와 비교하여 동맥 내 칼슘 감지 수용체의 발현이 감소된 것을 보여줍니다. 일단 숙달되면, 이 기술은 제대로 수행할 때 2시간 이내에 완료할 수 있습니다. 이 영상을 시청한 후, 여러분은 등척성 조건에서 외인성 화합물에 대한 소장 장간막 동맥의 혈관 반응성을 비교하는 방법에 대해 충분히 이해하게 될 것입니다.