동적 라이브 셀 이미징에 대한 호스트 병원체 상호 작용 연구를위한 광학 트랩의 사용

다음 실험의 전반적인 목적은 광학 트래핑과 회전 디스크 공초점 현미경을 결합하여 숙주-병원체 상호작용을 실시간으로 관찰하는 것입니다. 이는 먼저 챔버 커버 글라스에 관심 대상인 병원체를 첨가함으로써 이루어집니다. 그다음, 입자를 선택하여 광학 트랩으로 포착합니다.

마지막으로, 입자를 관심 세포로 유도합니다. 여기에서 보는 바와 같이, 광학 트래핑은 세포 내 동적 상호작용 관찰을 위해 두 개의 입자를 제어하는 효과적인 방법이 될 수 있습니다.

이 방법은 감염성 질환 및 면역학 분야에서 숙주-병원체 상호작용에 관한 중요한 질문들에 답할 수 있으며, 여기에는 숙주 세포와 병원체 간의 공간적 관계를 완전히 제어했을 때 phagocytosis에 미치는 영향과, phagocytic 세포에 의해 섭취되는 병원체의 순서가 phagosomal 성숙에 영향을 미치는지 여부 등이 포함됩니다. 일반적으로 이 방법에 익숙하지 않은 사용자는 세포 및 비드 유형에 따라 트래핑 조건을 최적화해야 하므로 어려움을 겪을 수 있습니다. spinning disc를 설정하고 통합하는 과정이 필요하므로, 이 방법에 대한 시각적 시연이 매우 중요합니다.

모든 광학 부품에 정밀한 정렬이 필요하기 때문에 광학 트랩(optical trap)에 공초점(confocal)을 맞추는 개념을 이해하기는 어렵습니다. 관심 대상인 병원균을 수집합니다. 예를 들어, 여기서는 배지에서 하룻밤 동안 배양한 Canada albicans 300 µL를 배양액에서 제거하여 1.5 mL 반응 튜브로 옮깁니다.

그런 다음 병원균을 상온에서 약 1300 Gs로 5분 동안 세 번 세척하며, 매회 상층액을 흡입하여 제거하고 펠렛을 그대로 둔 상태에서 재현탁용 PBS를 넣고 초음파 처리합니다. 세 번째 세척 후, 펠렛을 500 µL의 PBS에 재현탁합니다. 다음으로, dye of entrust 1 mg을 100 µL의 dimethylformamide에 녹여 최종 농도를 10 mg/mL로 조절합니다.

그런 다음 세척된 병원균이 들어 있는 반응 튜브에 염료 혼합물 3 µL를 추가합니다. 염료는 빛에 민감하므로 튜브 주변을 알루미늄 호일로 감싸고, 37 °C에서 1시간 동안 샘플을 흔들어 섞어준 뒤, 이전과 동일하게 PBS로 샘플을 3회 원심 분리하여 침전시키고 세척합니다. 마지막 세척 후 침전물을 300 µL의 PBS에 다시 현탁합니다.

워터배스에서 배지 trypsin과 PVS를 37 °C로 가온합니다. RAW 264.7 대식세포가 코팅된 10 cm 조직 배양 플레이트를 PBS로 2회 세척하며, 각 세척 단계 사이에 PBS를 흡입하여 제거합니다. 그다음, 플레이트 표면을 5 mL의 trypsin으로 덮고 37 °C에서 5분 동안 배양합니다.

그런 다음 플레이트 측면을 가볍게 두드려 세포를 플레이트 표면에서 분리합니다. 이때 트립신이 플레이트 외부로 튀지 않도록 주의하십시오. 이제 플레이트에 5 mL의 배지를 넣고 혼합물을 반응 튜브로 옮깁니다.

펠렛을 형성한 후, 펠렛이 흐트러지지 않도록 주의하며 배지를 흡입하여 제거하고 10 mL의 배지에 펠렛을 재현탁합니다. 챔버 슬라이드의 각 챔버에 400 µL의 배지를 넣은 다음, 각 챔버에 5 µL의 세포 현탁액을 첨가합니다. 세포를 37 °C, 5% CO2 조건의 인큐베이터에서 하룻밤 동안 배양합니다.

인큐베이터에서 챔버 슬라이드를 꺼내어, 이전에 준비한 형광 표지된 표적 병원체를 대식세포가 들어 있는 각 챔버에 5~10 µL씩 피펫팅합니다. 챔버 바닥에 닿아 부착된 대식세포가 떨어지지 않도록 주의하며, 피펫팅으로 대식세포와 병원체를 충분히 혼합합니다. 스피닝 디스크 공초점 현미경의 모든 구성 장치를 켭니다.

오일 침수 대물렌즈에 오일을 추가하여 현미경을 준비합니다. 챔버 슬라이드를 전용 스테이지에 삽입한 다음, 챔버 슬라이드의 상단을 제거하고 DIC 이미징을 위해 현미경을 정렬합니다. 광학 트랩 셔터와 IR 레이저를 켭니다.

그런 다음 광학 트랩으로 향하는 레이저의 셔터를 엽니다. IR 카드를 사용하여 IR 레이저 앞의 셔터가 닫혀 있는지 확인하십시오. 이제 부착된 슬라이드 위의 대식세포에 초점을 맞춥니다.

그런 다음 대식세포 인근의 용액 속에 자유롭게 떠다니는 병원균을 찾습니다. 이 과정에서 가장 어려운 부분은 시료 챔버 내의 물체와 커버 글라스 사이의 부착력으로 인해 시료 챔버에서 추적할 적절한 물체를 찾는 것입니다. 해당 물체를 이동시키려면 트래핑 레이저가 물체를 잡고 있는 동안 스테이지를 이동시켜야 하며, 스테이지의 항력이 트랩의 최대 포획력을 초과하지 않도록 충분히 느린 속도로 스테이지를 이동시켜야 한다는 점에 유의하는 것이 중요합니다.

병원체가 트랩 근처에 오도록 스테이지를 이동합니다. 그런 다음 셔터를 열고 트랩을 작동시킵니다. 샘플을 이동시켜 대식세포가 고정된 트랩 내의 병원체 이미지와 접촉하게 합니다.

회전 디스크 공초점 현미경의 DIC 형광 또는 두 방식의 조합을 사용하여, 일반적으로 크기가 약 5 µm인 *C. albicans*의 별개 군집들을 각각 녹색, 청색, 적색으로 표지했습니다. 이미징 능력을 보여주기 위해, 회색 화살표로 표시된 바와 같이 단일 *C. albicans*를 포획하여 다른 효모 군집 사이에서 사각형 패턴으로 이동시켰으며, 이는 밀집된 환경에서도 연산자가 선택한 특정 병원균의 위치를 포착하고 조작할 수 있음을 보여줍니다. 이 시스템이 병원성 미생물이 나타내는 다양한 형태학적 모양을 포획하는 유연성을 가지고 있음을 추가로 보여주기 위해, 광학 집게를 사용하여 가성 균사를 가진 *C. albicans* 입자를 고정하고 배치했습니다.

C albicans는 적색 염료로 염색되었으며, 흰색 화살표로 표시된 궤적을 따라 이동하여 녹색의 형광 GFPL C3 원시 세포 옆에 배치되었습니다. albicans의 효모 부분이 가성균사가 뒤따라오면서 포획되었습니다.

이 특정 세포주와 병원체 간의 식세포 작용의 절대적인 시간 프레임을 분석하기 위해 Aspergillus fumigatus를 생쥐 대식세포 옆에 배치했습니다. 이 그림의 명시야 이미지에서는 흰색 화살표로 표시된 포획된 aspergillus가 빨간색 화살표로 표시된 경로를 따라 어떻게 이동하고 배치되었는지 보여줍니다. 포획된 병원체는 트랩이 유기체를 초점 평면보다 약간 위로 밀어 올렸기 때문에 초점이 약간 맞지 않는 상태입니다.

Aspergillus를 원하는 생세포 옆에 배치될 때까지 이동시켰습니다. 병원균이 세포와 접촉하자 트랩을 껐습니다. 이후 식세포 작용 과정이 활성화되었으며, 타임랩스 이미징을 통해 이어지는 세포 내 사건들을 관찰하였습니다.

30초에 생세포의 막이 변화하기 시작하며 입자 주변으로 컵 모양의 구조를 형성했습니다. 60초에 컵 모양이 완전히 형성되었습니다. 90초부터 150초까지 Afu Gotti가 입자를 감싸 안았으며, 180초에 입자가 완전히 내부로 섭취되었습니다.

이 영상을 시청한 후, 회전 디스크 광학 트랩 장치를 제작하는 방법과 이러한 장치를 통해 생세포 이미징을 위해 병원균을 비침습적으로 제어하는 방법을 충분히 이해하게 될 것입니다. 이 기술은 숙주-병원균 상호작용 분야의 연구자들이 숙주 세포와 병원균 간의 공간적 관계의 역할 및 그것이 이후의 면역 반응에 미치는 영향을 조사할 수 있는 길을 열어주었습니다.