총 RNA의 분리 및 다운 스트림 차세대 시퀀싱 및 유전자 발현 프로 파일링에 대한 개별 마우스 뇌 영역의 Microdissection 아닌 레이저 캡처 현미경 접근법

본 절차의 전반적인 목표는 반복 가능하고 일관되며 비용 효율적인 방식으로, RNase가 없는 환경에서 특정 뇌 핵(nuclei)으로부터 총 RNA를 수집하는 것입니다. 이는 먼저 RNase-free 작업 환경을 조성하고 참수된 마우스에서 뇌 전체를 적출함으로써 달성됩니다. 그다음, 마이크로미터 작동 방식의 조직 절단기(tissue chopper)를 사용하여 균일한 크기의 연속 조직 절편을 절단합니다.

그 후, RNA가 없는 배지 환경에서 조직을 유지하면서 일정한 직경의 조직 코어를 사용하여 관심 있는 뇌 영역을 미세 절제합니다. 마지막으로, 절제된 뇌핵에서 총 RNA를 분리합니다. 최종적으로, 분광 광도법 또는 형광 측정법 분석을 통해 하위 cDNA 라이브러리 제작 및 전사체 프로파일링에 충분한 총 RNA 수율과 품질을 나타내는 결과를 얻을 수 있습니다.

육안 해부학적 방법이나 레이저 캡처 미세절단법을 이용한 뇌 영역 절제와 같은 기존 방법과 비교했을 때 이 기술의 주요 장점은, 개별 마우스 뇌에서 관심 있는 여러 개의 불연속적인 뇌 영역을 반복 가능하고 비용 효율적인 방식으로 수집할 수 있다는 점입니다. 이 방법은 신경 회로가 없는 뇌 영역 내의 서로 다른 전사체 발현 프로필이 특정 행동 특성, 환경 반응 및 질병 상태와 상관관계가 있는지와 같은 신경과학 분야의 핵심 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 미세절단을 준비하기 위해 100 milliliters의 Earl's balanced salt solution(EBSS)에 0.44 grams의 sodium bicarbonate와 0.884 grams의 glucose를 첨가하십시오.

오토클레이브 멸균 가능한 스크류 캡 병 또는 플라스크에 EBSS와 0.1 milliliters의 DEPC를 넣고 37 °C에서 최소 12시간 동안 처리합니다. 5.75 inches 길이의 유리 피펫을 1 liter 유리 비커에 넣고, 브리슬이 위를 향하도록 한 예술용 붓들을 100 milliliter 유리 메스실린더에 넣습니다.

피펫과 브러시가 충분히 잠길 정도로 DEPC 처리된 증류수를 추가합니다. 비커와 메스실린더를 알루미늄 호일로 덮고 37 °C에서 최소 12시간 동안 배양합니다. DEPC를 이용한 12시간 배양 후, 모든 DEPC 처리 재료를 100 °C 이상의 온도에서 최소 15분 동안 가열합니다. 냉각합니다. 4 °C에서 보관하기 전 EBSS를 상온으로 식힙니다.

비커와 메스실린더에서 DD H2O를 따라내고, 재료가 건조될 때까지 100 °C 이상의 온도에서 계속 배양합니다. 인큐베이터에서 꺼내 실온까지 식힌 후 나중에 사용할 수 있도록 보관합니다. 실험 당일에는 모든 작업 표면을 처리하여 RNA 오염을 제거하고, EBSS를 40 °C로 설정된 워터 배스에 두어 완충 및 산소 공급 상태를 유지합니다.

가스 튜브를 RNA free 파스퇴르 피펫에 넣고, 이 피펫을 EBSS에 삽입한 뒤 EBSS 용기의 입구를 덮어 5%CO2와 95%산소로 포화시킵니다. 뇌 조직의 연속 절편 제작을 위해 조직 절편기를 설정합니다.

조직 절단기의 상단 및 하단 표면을 처리합니다. RNA 오염을 제거하기 위해, 조직 절단기의 플렉시글라스 표면에 직사각형 모양의 Whatman 4번 여과지를 부착합니다. 절단기 암(arm)에 양날 면도날을 부착합니다.

마이크로미터를 0으로 설정하고 초퍼 암(chopper arm)의 최소 높이를 조절하여, 면도날이 필터 페이퍼는 절단하되 플렉시글라스 플레이트는 절단하지 않도록 합니다. RNA-free 60 by 15 millimeter 세포 배양 접시, 조직용 200 µL RNA-free 마이크로 피펫 팁, 곡선 가위, 드라이아이스, 조직 수집용 튜브를 포함하여 미세 해부에 필요한 모든 추가 재료를 준비합니다. 설치류용 기요틴을 사용하여 마우스의 머리를 절단하고, 후뇌와 시신경이 모두 온전한 상태로 전체 뇌를 적출한 후 튜브를 드라이아이스 위에 놓습니다.

뇌를 60 x 15 mm RNAse-free 세포 배양 접시 상단에 놓습니다. 그런 다음 이를 조직 샘플링 작업대로 옮깁니다. RNAse-free 피펫을 사용하여 조직 쵸퍼(tissue chopper)에 부착된 필터 페이퍼를 EBSS로 적당히 적셔 줍니다.

EBSS로 뇌 조직을 적십니다. 뇌를 조직 절단기(tissue chopper)로 옮기고, 복측 표면이 여과지에 닿도록 배치합니다. 이때 정중선은 절단기 날과 수직이 되어야 하며, 뇌의 전방 가장자리가 날에 밀착되도록 합니다.

A-D-E-P-C 처리된 아티스트 브러시를 사용하여 뇌의 등쪽 표면에 가벼운 압력을 가해 뇌를 고정합니다. 블레이드 홀더 레버를 등쪽 조직 표면에서 약 4~5cm 높이로 들어 올려 이 상태를 유지합니다. 뇌 표면에서 브러시를 제거하고 750 µm로 다이얼을 맞춥니다.

마이크로미터를 사용합니다. 레버를 내려 조직을 절단함으로써 초퍼 블레이드가 고정된 상태에서 750 µm 두께의 관상면 절편을 생성합니다. 아티스트 브러시를 굴리듯 움직여 조직 절편을 블레이드 표면에서 부드럽게 걷어냅니다.

조직 절편을 페트리 접시에 담긴 산소 공급 EBSS에 즉시 넣습니다. 이제 이 슬라이스는 미세 해부 준비가 완료되었습니다. 미세 해부를 수행하기 위해 전체 전후(rostrocaudal) 평면에 걸쳐 연속적인 뇌 절편을 얻을 때까지 슬라이싱 과정을 반복합니다.

먼저, 샘플 조명이 가려지지 않는지 조명을 확인합니다. 조직에 완충된 산소 공급 환경을 유지하도록 O2 CO2 혼합 가스의 위치와 유량을 조절합니다. 시술 과정 중에 관심 영역이 포함된 뇌의 관상 단면을 확인하고, 미술용 붓을 사용하여 이를 페트리 접시 바닥에 평평하게 놓습니다.

적절한 직경의 조직 코어를 선택하십시오. 미술용 붓으로 관상면 조직 절편을 고정하고, 조직 코어의 절단 팁을 조직 절편 표면 위로 내립니다. 압력을 가하면서 조직 코어 팁을 조직 절편과 페트리 접시 바닥까지 단단하게 누르십시오.

회전시키는 원형 동작을 사용하여 관심 영역이 주변 조직으로부터 완전히 분리되었는지 확인하십시오. 세밀한 붓을 사용하여 조직 코어를 조직 절편에서 조심스럽게 들어 올려 마이크로 펀치가 EBSS 내에서 떠 있도록 분리합니다. 즉시 조직 마이크로 펀치를 드라이아이스 위에 보관된 -80 °C 안정 보관 튜브에 넣으십시오.

조직이 튜브 벽에 쉽게 부착되어야 합니다. 마이크로 샘플이 담긴 튜브를 다시 드라이아이스에 넣으십시오. 관심 있는 각 뇌 영역에 대해 이 미세절제술을 반복하십시오.

마이크로디섹션이 완료되면, 각 샘플이 담긴 튜브의 라벨 또는 바코드를 기록하십시오. 조직 샘플에서 RNA를 추출하기 전까지 조직 샘플을 -80 °C 냉동고에 보관하십시오. 먼저, RNA-free 작업 공간을 준비하십시오.

전체 RNA 분리 키트 매뉴얼에 기술된 대로 충분한 양의 자성 비드 혼합물과 용해 결합 용액을 준비합니다. -80 °C 냉동고에서 조직 샘플을 꺼내 튜브를 즉시 드라이아이스 위에 놓습니다. 샘플 튜브에 용해 결합 용액 100 µL를 첨가합니다.

펠렛 믹서에 뉴클레아제 프리 0.5 mL 튜브용 페스틀을 장착하고, 저흡착 뉴클레아제 프리 피펫 팁을 사용하여 조직을 균질화합니다. 균질화된 시료를 동일한 종류의 팁을 사용하여 즉시 라운드 바텀 96웰 조직 배양 플레이트의 웰로 옮깁니다. 시료에 100% 이소프로판올 60 µL를 첨가합니다.

샘플에 비드 믹스 20 µL를 첨가하고 피펫팅으로 3~4회 섞어줍니다. 총 RNA 분리 키트 프로토콜의 단계에 따라 총 RNA 추출을 완료합니다. 마지막으로, 결과물인 총 RNA의 순도와 농도를 측정합니다. 다양한 뇌 영역의 마이크로 펀치로부터 얻은 총 RNA 데이터가 이 표에 제시되어 있습니다.

30 µL의 elution Buffer로 용출한 RNA 샘플은 RNA 시퀀싱 응용 분야를 위한 시판 CD NA 준비 제품에서 사용하기에 충분한 총 RNA를 제공하였습니다. 또한, RNA 수율과 260/280 비율은 각 마이크로디섹션 샘플에서 얻은 단일 값으로, 각 뇌 영역에서 얻은 측정값을 보여주며 높은 샘플 순도를 확인해 줍니다. 이 기술은 숙달되면 적절하게 수행할 경우 8~10분 내에 완료할 수 있습니다. 이 절차를 시도할 때, RNA-free 또는 DEPC 처리된 재료만 사용하여 작업 표면이나 조직 샘플의 RNA 오염 위험을 최소화하는 것이 중요합니다.