Drosophila에서 등쪽 종근 신경근 접합부의 구조적 무결성 평가

완충액에 화학적으로 고정된 야생형 및 형질전환 초파리 흉부로 시작합니다.

형질전환 흉부에서 등쪽 세로 근육의 신경근 접합부에는 신경변성을 유도하는 돌연변이 단백질을 발현하는 뉴런이 포함되어 있습니다.

완충액을 제거하고 흉부를 급속 동결하여 이등분술 중 조직 손상을 방지합니다.

신선한 완충액을 추가하고 흉부를 해부 접시로 옮깁니다.

흉부 복부 쪽을 위로 향하게 하고 신경 세포 클러스터를 제거하여 정중선을 노출시킵니다.

정중선을 따라 이등분하여 반미토레이스를 얻습니다.

과도한 조직을 제거합니다.

투과화하고 비특이적 항체 결합을 방지하기 위해 차단 완충액에서 헤미토레이스를 배양합니다.

NMJ 뉴런 및 근육 액틴 필라멘트에서 발현되는 당단백질을 표적으로 하는 형광단 접합 항체를 추가합니다.

결합되지 않은 항체를 제거합니다.

브릿지 슬라이드에 반경세를 배열하고 마운팅 매체를 추가한 다음 조직을 장착합니다.

현미경으로 시각화합니다.

야생형에 비해 돌연변이는 신경 염색이 감소하여 신경 퇴행을 나타내는 반면 근육은 온전한 형광을 나타냅니다.

이등분을 시작하기 전에 냉동 보호 장갑과 보안경을 착용하고 듀어 플라스크에 액체 질소를 채웁니다. 블레이드 브레이커를 사용하여 깃털 블레이드를 비스듬히 잡고 블레이드를 구부려 작은 조각을 부러뜨립니다. 블레이드 브레이커를 사용하여 블레이드를 제자리에 고정하고 유리 파스퇴르 피펫을 사용하여 샘플 튜브에서 모든 PBS를 제거합니다.

극저온 핀셋을 사용하여 액체 질소 플라스크에 튜브를 담그십시오. 10초 후, 파스퇴르 피펫을 사용하여 얼음 위의 각 튜브에 약 300마이크로리터의 얼음처럼 차가운 PBS를 추가하고 얼음처럼 차가운 PBS가 들어 있는 10cm 실리콘 엘라스토머 코팅 해부 접시에 가슴 복부 쪽이 위로 향하도록 놓습니다. 무딘 겸자를 사용하여 흉부를 배치하고 미세한 겸자를 사용하여 흉부 신경절의 일부를 제거하여 흉부의 정중선을 노출시킵니다.

흉부의 정중선을 가이드로 사용하여 칼날을 사용하여 흉부의 1/3을 얕게 자르고 무딘 집게를 사용하여 흉부를 45도 각도로 배치합니다. 칼날을 사용하여 흉부의 정중선을 똑바로 절단하여 두 개의 혈흉을 얻고 조심스럽게 한두 번 절단하여 등쪽 세로 근육을 손상시키지 않고 과도한 조직을 제거합니다. 그런 다음 근육 조직 샘플을 적절하게 라벨링된 PBS 튜브에 넣습니다.

모든 흉부 샘플이 이등분되면 섭씨 4도에서 최소 1시간 동안 차단 완충액에서 조직을 투과화합니다. 배양이 끝나면 새로 준비된 구조용 염색 용액을 소용돌이치고 각 샘플에 150마이크로리터의 염색을 첨가하여 어둠 속에서 실온의 회전기에서 2시간 동안 배양합니다. 염색 후 샘플을 PBST로 세척하고 5개의 강화 라벨을 15밀리리터 간격으로 반으로 쌓아 놓고 하나의 유리 현미경 슬라이드에 놓습니다.

수정된 마이크로피펫 팁을 사용하여 흉부를 각 슬라이드에 옮기고 실험실 물티슈를 사용하여 과도한 PBST를 제거합니다. 집게를 사용하여 흉부가 근육면이 위를 향하도록 샘플을 배열합니다. 샘플의 방향이 올바르면 200마이크로리터 피펫 팁을 사용하여 각 슬라이드에 70마이크로리터의 마운팅 매체를 바르고 각 슬라이드를 커버슬립으로 덮습니다. 그런 다음 매니큐어를 사용하여 커버슬립의 바깥쪽 가장자리를 넉넉하게 코팅하여 각 조직 주위를 완전히 밀봉합니다.