단일 셀 RT - PCR 기법을 사용 Nigral 뉴런의 전압 - 문이 칼륨 채널 mRNA의 표현을 프로파일

이 절차의 전반적인 목표는 개별 뉴런에서 메신저 RNA를 검출하는 것입니다. 이는 패치 클램핑을 통해 개별 뉴런을 기록한 후, 기록된 각 뉴런에서 mRNA와 세포질이 포함된 세포질을 완전히 흡입함으로써 수행됩니다. 이후 cDNA를 제작하고 PCR로 증폭합니다.

최종적으로, 수용체 이온 채널 및 효소에 대한 특정 mRNA는 일반적인 겔 이미징 시스템을 통해 검출할 수 있습니다. 저는 University of Tennessee Health Science Center에서 근무하는 [이름]입니다. 일반적으로 이 방법에 익숙하지 않은 분들은 단일 뉴런 내의 mRNA 양이 극히 적어 쉽게 손실될 수 있기 때문에 어려움을 겪을 수 있습니다.

먼저 진동 절편기를 사용하여 흑질의 중전방 부위를 포함하는 300 µm 두께의 뇌 관상면 절편을 제작하여 이 프로토콜을 시작합니다. 뇌는 15~40일 된 Sprague-Dawley 쥐로부터 분리할 수 있습니다. 절편 제작 과정은 95% oxygen 및 5% carbon dioxide로 산소화되고 pH 7.4인 고농도 sucrose 절단 용액 내에서 얼음 위 냉장 상태로 수행됩니다. 이후 절편을 5% carbon dioxide 및 95% oxygen 가스로 버블링한 인공 뇌척수액에 넣어 배양합니다.

온도를 34°C로 유지하고 슬라이스를 45분 동안 둡니다. 그 후 기록 전까지 뇌 슬라이스를 상온에서 보관하십시오. 먼저 뇌 슬라이스 하나를 패치 클램프 기록 챔버로 옮기면서 시작합니다.

32°C의 산소화된 인공 뇌척수액으로 지속적으로 관류합니다. DNAs 및 RNAs free water로 조제하여 오토클레이브 멸균한 세포 내 용액을 패치 피펫에 채웁니다. 용액이 채워진 피펫을 배스(bath) 안으로 내립니다.

저항이 2~3 MΩ 사이인지 확인하십시오. 먼저, 해부학적 위치를 통해 흑질을 찾으십시오. 그 다음, namar 광학과 60x 대물렌즈를 사용하여 기록을 위한 SNC와 SNR의 대형 세포를 선택하십시오.

이들은 망설임 없이 도파민성 또는 GABA성 뉴런일 가능성이 큽니다. 일반적인 gigaseal whole-cell 구성을 사용하여 전류 클램프 및 전압 클램프를 수행하십시오. mRNA 분해를 최소화하기 위해 이러한 기록은 일반적으로 5분 이내에 완료해야 합니다.

약 1분 내에 세포막 전위 및 스파이킹 특성만을 기록함으로써 관심 뉴런의 전기생리학적 지문을 제공할 수 있습니다. 관심 뉴런으로부터 데이터를 얻은 후, 입으로 가볍게 흡입하여 세포질을 제거하십시오. 이때 기밀 봉인(tight seal)이 깨지지 않도록 주의해야 합니다.

mRNA를 포함한 세포 외 잔해물이 패치 피펫 안으로 빨려 들어가 세포 내용물을 오염시킬 수 있습니다. 피펫 팁을 부러뜨리고 가벼운 양압을 가하여 세포 내용물을 0.2 milliliter PCR 튜브에 배출하십시오. 완료 후, mRNA를 포함할 수 있는 세포 외 잔해물에 의한 오염을 방지하기 위해 즉시 튜브를 -20°C 냉동고에 보관하십시오.

흡입 과정을 거치지 않고 조직 내로 진입시킨 패치 피펫의 내부 성분을 수집하여 음성 대조군을 만듭니다. 10~20개의 뉴런으로부터 세포 성분을 수집한 후 즉시 역전사 반응을 시작하십시오. mRNA의 분해를 최소화하기 위해, 먼저 DNase I을 사용하여 25°C에서 5분 동안 오염된 게놈 DNA를 분해합니다.

이 단계는 잠재적인 위양성을 줄이는 데 매우 중요하므로 생략해서는 안 됩니다. 그런 다음 25 millimolar EDTA 1.2 µL를 넣어 DNA를 불활성화하고, 샘플을 70 °C에서 5분 동안 배양하십시오. 이제 시판 키트를 사용하여 CD NA를 합성함으로써 게놈 DNA가 완전히 제거되었는지 확인하십시오.

역전사 효소 없이 각 샘플의 대조군 반응을 수행합니다. 이때 다른 모든 반응 구성 요소는 동일하게 유지합니다. 생성물은 PCR 설계에 필요할 때까지 -20°C에서 보관하십시오.

가능한 경우 GenBank의 서열에 따라 프라이머를 제작하고, 게놈 DNA 오염을 감지할 수 있도록 인트론에 걸쳐 있는 프라이머를 설계하십시오. 프라이머 쌍의 효율성을 확인하기 위해, 1단계에서는 전체 뇌 cDNA를 사용하여 테스트하십시오. 표준 열 사이클링 프로토콜을 사용하여 30 $\mu$L의 cDNA 중 5 $\mu$L를 35회 cycle로 PCR 증폭하십시오.

두 번째 단계에서는, 동일한 프라이머 쌍을 사용하여 1 µL의 1단계 PCR 산물을 PCR 증폭시키며, 약간 수정된 사이클링 프로파일을 적용합니다. 이제 산물을 2.5% AGROS 겔에서 분리하고 EtBr 또는 GelGreen을 사용하여 시각화합니다. UV 광선 아래에서 양성 DNA 밴드를 절취하고, 시판되는 키트를 사용하여 DNA를 수집하고 서열 분석을 수행합니다.

흑질 치밀부와 망상부 뉴런의 전기생리학적 특성을 비교하였다. SNR GABA 작동성 뉴런은 약 10 Hz의 빈도로 더 높은 빈도의 자발적 스파이킹을 보였다. 스파이크는 과분극 전류 주입 시 기저 지속 시간이 약 1 ms였다.

SNR GABAergic 뉴런은 약한 SAG 반응을 보여 약한 활성화 전류를 나타냈습니다. 반대로, 흑질 도파민성 뉴런은 기저 지속 시간이 약 3ms인 저빈도 자발적 스파이크를 보였습니다. 또한 도파민성 뉴런은 과분극에 반응하여 뚜렷한 SAG를 보였으며, 이는 SNR GABAergic 뉴런에서는 IH 전류가 강하게 발현되었으나 도파민성 뉴런에서는 그렇지 않았음을 나타냅니다.

단일 세포 R-T-P-C-R을 통해 GABA 합성의 핵심 효소인 글루탐산 탈탄산효소 1(glutamic acid decarboxylase one)의 mRNA를 검출하였습니다. 이와 대조적으로, 확인된 SNC 및 SNR 도파민성 뉴런에서는 검출되었으나, GABA성 뉴런에서는 검출되지 않았습니다. 단일 세포 R-T-P-C-R을 통해 도파민 합성의 핵심 효소인 티로신 수산화효소(tyrosine hydroxylase)의 mRNA를 검출하였습니다.

다음으로, 전압 개폐성 potassium 채널의 특성을 변화시키는 전압 활성 KV 3 채널 서브유닛의 발현 프로파일을 분석하기 위해 단일 세포 R-T-P-C-R을 사용하였습니다. SNR gaba 예시의 경우, KV 3.1, 3.2, 3.3 및 3.4에 대한 뉴런 mRNA는 예시 S-N-R-D-A 뉴런에서만 검출되었습니다. KV 3.2, 3.3 및 3.4는 풀링된 데이터(pooled data)에서 검출되었습니다.

KV 3.1은 흑질 도파민 작동성 뉴런보다 SNR GABA 작동성 뉴런에서 더 빈번하게 검출되었으며, 이는 속동성 SNR GABA 뉴런에서 KV 3.1의 발현 수준이 더 높음을 나타냅니다. 이 절차를 수행하는 동안 장갑을 착용하고, 도구 개발 후에는 오염되지 않도록 청결하게 유지하는 것이 중요합니다. 이 기술은 신경과학 분야의 연구자들이 신경계 내 수용체와 이온 채널의 발현 및 기능을 탐구할 수 있는 길을 열어주었습니다.