에틸렌 글리콜 기반 Vitrification에 의한 마우스 태아의 Cryopreservation

이 실험 절차의 전반적인 목표는 마우스 배아를 액체 질소에 동결 보존하고, 이를 해동하여 살아있는 마우스를 회복시키는 것입니다. 이는 먼저 마우스 배아를 평형화 배지에 담근 후, 크라이오 튜브 내의 유리화 배지로 옮기고, 다시 액체 질소 탱크에 배치함으로써 수행됩니다. 이후 배아는 고삼투압 배지에서 해동되며, 수용 암컷에 이식될 때까지 배양 배지에서 배양됩니다.

최종적으로, 유리화 동결 해동 후 배아의 생존율은 90% 이상이었으며, 배아 이식 후 출생률은 30%에서 70% 사이로 나타났습니다. 이 기술의 주요 장점은 투과성 동결보호제인 glycol이 기존의 동결보호제보다 배아에 대한 독성이 적다는 점입니다. 본 프로토콜을 시작하기 전, 저희 실험실의 기술자가 해당 절차를 시연할 예정입니다.

자연 교배 또는 일반적인 IVF 기술로 얻은 2세포 마우스 배아 두 개를 최종 보관을 위해 크라이오 튜브에 준비하고, 배아 동결액 EF S 40 50 µL를 첨가합니다. 그다음 35 mm 또는 60 mm 플라스틱 페트리 접시에 상온의 EFS 20 50 µL를 준비합니다.

유리 모세관을 사용하여 최대 30개의 배아를 디쉬로 옮깁니다. 이때 배양액이 함께 옮겨지지 않도록 주의하십시오. 또한 배아의 탈수를 방지하기 위해, 배아를 방울의 바닥 부분에 배치하십시오.

약 60~90초 후에 모세관을 사용하여 수축된 형태의 탈수된 배아를 흡입합니다. 이 배아들을 크라이오 튜브 내의 EFS 용액으로 옮기되, EFS 20은 가능한 한 적게 옮깁니다.

배아를 옮긴 후, 액체 질소에 냉동시키기 전 EFS 40에서 1분 동안 안정화시킵니다. 배아를 해동하기 전에 M 16 배지와 같은 고삼투압 배아 배양액 10 µL를 배양 접시에 최소 두 방울 떨어뜨립니다. 그 다음, 실리콘 오일 또는 미네랄 오일로 방울을 완전히 덮고, 사용할 때까지 접시를 이산화탄소 배양기에 보관합니다.

다음으로, 안면 마스크와 저온 장갑을 착용한 상태에서 TS one 용액을 37 °C로 가온합니다. 액체 질소 탱크에서 배아를 꺼냅니다. 이제 저온 튜브를 빠르게 열고, 액체 질소는 탱크나 적절한 용기에 버립니다.

그런 다음 30초 동안 기다립니다. 이제 가온된 TS one 용액 850 µL를 크라이오 튜브에 첨가합니다. 용액이 균일하게 용해되도록 부드럽게 흡입하고 배출하는 과정을 약 10회 반복합니다.

그런 다음 전체 부피를 60 millimeter 플라스틱 페트리 접시나 시계 접시로 옮깁니다. 배아가 상온에 적응할 수 있도록 3분 동안 기다리며, 이후의 모든 과정 동안 배아는 상온 상태를 유지해야 합니다. 가온 장치는 사용하지 마십시오.

실체 현미경으로 디쉬 내의 배아를 빠르게 관찰하여 배양 시작 시점의 상태를 확인합니다. 약 2분간 배양한 후, 배지가 디쉬 표면에 넓게 퍼질 때까지 디쉬를 부드럽게 흔들어 배아를 가라앉힙니다. 배양 마지막 1분에 TS two 용액 50 µL 방울 세 개를 디쉬에 각각 분주합니다.

3분이 지나면 실체 현미경을 사용하여 배아가 약간 수축되었는지 확인하십시오. 배아가 여전히 부풀어 있다면, 1~3분 더 배양을 계속하십시오. 이제 유리 모세관으로 배아를 집어 TS two의 첫 번째 방울로 옮기십시오.

3분 동안 대기한 후 배아를 두 번째 방울로 옮깁니다. 이어서 세 번째 방울로 옮깁니다. 마지막으로, 인큐베이터에 보관해 두었던 배아 배양액 접시를 꺼내어 유리 모세관을 사용하여 배아를 배양액의 첫 번째 방울로 옮깁니다.

실체 현미경으로 관찰했을 때, 배아는 서서히 정상적인 형태를 회복해야 합니다. 이제 배양 접시를 인큐베이터에 넣고 약 10분 동안 둡니다. 그런 다음 TS 2에서 이월된 수크로스를 씻어냅니다.

배아를 다음 배양액 방울로 옮깁니다. 수혜 암컷의 uc로 이식할 때까지 CO2 배양기에서 배아 배양을 계속합니다. 세 가지 서로 다른 마우스 계통에서 300~480개의 배아를 유리화 및 회복시킨 후, 생존율이 매우 높게 나타났습니다.

해동 후, 정상적인 형태를 보이는 배아의 비율은 93%에서 99% 사이였으며, 해당 배아 중 적어도 84%가 포배낭으로 발달했습니다. 액체 질소를 다루는 작업은 매우 위험할 수 있으므로, 직접적인 접촉을 피하고 짧은 거리에서의 노출을 최소화하기 위한 예방 조치를 취해야 함을 잊지 마십시오. 질소를 취급할 때는 항상 이 절차를 수행해야 합니다.