Hoechst의 분리 및 특성 ^낮은 CD45 ^부정적인 마우스 폐 Mesenchymal 줄기 세포

본 영상에서는 호스트의 CD 45 음성 폐 중간엽 줄기세포를 분리하는 프로토콜을 시연합니다. 조직 상주 중간엽 줄기세포(MSC)는 조직 수복 또는 재생, 섬유화, 염증 및 혈관 형성의 중요한 조절 인자입니다. 먼저, 희생시킨 마우스에서 폐를 적출합니다.

단일 세포 현탁액을 얻기 위해 폐 조직을 소화시킵니다. 세포를 hoax die와 CD 45로 염색한 후, 유세포 분석법으로 분류하여 호스트 유래 CD 45 음성 폐 MSC를 얻습니다. 이후 폐 MSC를 배양하여 증식시키고, MSC의 분화 능력을 평가하기 위해 콜로니 형성 분석을 수행합니다.

그 후, 조직 항상성 및 질환 과정에서 MSC의 역할을 조사하기 위한 추가 연구를 수행할 수 있습니다. 본 과정에서 제시한 방법은 마우스 또는 인간의 폐 중간엽 줄기세포를 분리하는 데 사용될 수 있으며, 폐섬유화증, 폐고혈압 및 COPD와 같은 폐 질환 연구에 적용 가능합니다. 일반적으로 이 방법에 익숙하지 않은 사용자는 조직 준비 방법의 다양성뿐만 아니라, 유세포 분석기의 적절한 대조군 설정 및 분석 과정에서 어려움을 겪을 수 있습니다.

세포의 최적 생존력을 위해 폐 조직을 다지고 소화하는 적절한 기술을 글로만 설명하기는 어렵기 때문에, 이 방법의 시각적 시연이 매우 중요합니다. 또한, 유세포 분석기의 설정 및 분석 과정 역시 시연을 통해 가장 잘 전달될 수 있습니다. 희생된 성체 마우스에서 중간엽 줄기세포를 얻기 위해 폐를 적출하는 것으로 이 프로토콜을 시작하십시오.

작고 날카로운 가위로 마우스의 늑골 양측을 측면으로 절개합니다. 흉강을 연 다음 횡격막을 제거합니다. 20.5 gauge 바늘이 장착된 10 milliliter 주사기를 우심실에 삽입하고 플런저를 천천히 눌러 3~5 milliliters의 PBS로 관류하여 폐에서 혈액을 씻어냅니다.

다음으로 가위를 사용하여 기관과 대기관지를 잘라내어 폐기합니다. 그 다음 핀셋을 사용하여 작은 흰색 폐엽을 집어 HBSS(hank's buffered saline)가 채워진 페트리 접시에 넣습니다.

그런 다음 심장을 제거하고 폐엽을 분리합니다. 연구에 포함된 모든 마우스에 대해 이 과정을 반복합니다. 분리한 폐엽을 디쉬 뚜껑으로 옮깁니다.

조직이 마르지 않도록 적당량의 HBSS를 사용하여 적셔줍니다. 그다음 일회용 메스를 사용하여 폐엽을 잘게 다져 유세포 분석의 유지 대조군으로 사용할 골수를 얻습니다. 날카로운 가위를 사용하여 발목과 대퇴골 상단을 절단합니다.

사지를 새 페트리 접시에 넣습니다. 그 후 무릎 부위를 절단하여 대퇴골의 직선 부분과 경골 및 비골이 포함된 두 번째 조각으로 나눕니다. 핀셋을 사용하여 근육을 제거해 경골, 비골 및 대퇴골이 드러나게 합니다.

이제 26.5 gauge 바늘이 장착된 5 mL 시린지를 사용하여 바늘을 골수 개구부에 삽입하십시오. 경골(tibia)의 한쪽 끝을 잡고 다른 쪽 끝이 15 mL HBSS가 채워진 50 mL 원심 분리 튜브(conical tube)를 향하게 한 다음, 플런저를 눌러 HBSS를 주입함으로써 골수를 튜브 안으로 씻어내십시오. 비골(fibula)과 대퇴골(femur)에 대해서도 이 과정을 반복하십시오.

보충된 고농도 포도당 DMEM에서 5 µg/mL의 최종 농도로 host 3 3 3 4 2 염색약을 사용하여 골수를 염색합니다. 다음으로, 분리된 조직으로부터 폐 조직의 단일 세포 현탁액을 생성합니다. 각 폐를 예열된 0.2% Worthington이 포함된 튜브에 넣습니다.

멸균된 HBSS로 제2형 콜라게나제(Type two collagenase)를 준비한 후, 튜브를 37 °C 항온수조에 담가 30분 동안 배양합니다. 배양 후, 10 mL 피펫을 사용하여 소화물이 피펫을 통해 쉽게 흐를 때까지 샘플을 트리투레이션(trituration)합니다. 약 10회 반복한 뒤, 조직 소화를 완료하기 위해 37 °C에서 15분 동안 추가로 배양합니다.

소화가 완료되면, HBSS로 세포 현탁액을 희석하고 5 mL 피펫을 사용하여 남아 있는 조직 파편을 다시 분산시킵니다. 다음으로, 소화되지 않은 조직 파편을 제거하기 위해 현탁액을 70 µm 세포 스트레이너를 통해 50 mL 원추형 튜브에 붓습니다. 샘플이 세포 스트레이너를 통해 원활하게 흐를 수 있도록 현탁액을 조금씩 추가합니다.

소화되지 않은 조직 파편이 세포 현탁액의 흐름을 완전히 차단하는 경우, 새로운 세포 스트레이너를 통해 새 튜브에 부어줍니다. 세포 현탁액을 450 RCF에서 10분 동안 원심분리하여 펠렛을 형성합니다.

원심분리 후 상층액을 따라내고, 실온의 적혈구 용해 버퍼(Red blood cell lysis buffer)로 세포 펠렛을 부드럽게 재현탁하여 실온에서 5분 동안 배양합니다. 그 다음, 동일한 부피의 HBSS를 첨가하여 용해 버퍼를 불활성화합니다.

세포 현탁액을 40 µm 세포 스트레이너(cell strainer)에 부어 잔해물과 세포 응집체를 제거하고, 통과한 액체를 새로운 50 mL 원추형 튜브(conical tube)에 수집합니다. 다음으로, 혈구계수기(hemocytometer)를 사용하여 폐와 골수 샘플 모두의 세포 수를 측정합니다. 세포 현탁액의 농도와 총 부피를 기록합니다.

그 다음, 단일 폐 세포 현탁액을 450 RCF에서 10분 동안 원심분리하여 펠렛화합니다. 세포를 유지하기 위해 폐 세포와 골수 세포를 동시에 10⁶ cells/mL의 농도로 미리 데워둔 보충제 함유 고농도 포도당 DMEM에 재현탁합니다.

DNA를 염색하기 위해 HOAXED 3 3 3 4 2 염료를 최종 농도가 5 µg/L가 되도록 첨가합니다. 다음으로, 세포를 부드럽게 전도 혼합하고 37 °C 항온수조에서 정확히 90분 동안 배양합니다. 그 후 4 °C에서 450 ×g로 10분 동안 원심 분리합니다.

유세포 분석을 위한 준비 단계로, 폐 및 골수 조직을 anti CD 45와 propidium iodide로 염색합니다. 세포 염색이 완료되면 유세포 분석을 수행할 때까지 튜브를 빛이 차단된 상태로 얼음 위에 보관하십시오. 기기의 레이저 정렬 상태를 확인하고 세포 분리(cell sorting) 설정이 완료되었는지 확인하여 유세포 분석을 준비합니다.

사용되는 기기는 488 nm 청색, 635 nm 적색 및 350~355 nm UV 레이저를 갖추어야 하며, UV 레이저 경로에는 청색 45/65 필터와 적색 675/50 필터가 장착된 두 개의 검출기가 있어야 합니다. 또한, UV 적색 검출기는 적색 신호에 대해 높은 민감도를 가져야 하며, 기기에는 샘플을 10 °C로 유지하기 위한 칠러 유닛이 장착되어 있어야 합니다. 기기 소프트웨어 설정에서 선형 전방 산란(forward scatter) 대 측방 산란(side scatter)을 표시하는 히스토그램 플롯과 해당 기기에 적합한 더블릿 식별(doublet discrimination) 플롯을 설정하십시오.

로그 신호를 사용한 PI의 히스토그램 플롯, 선형 신호를 사용한 적색 대 청색 코스트, 그리고 로그 신호를 사용한 CD 45 A PC의 히스토그램 플롯입니다. 장비가 준비되면, 염색된 골수 샘플을 장비의 로딩 포트에 넣으십시오. 이 샘플은 염색 및 장비 설정 제어용으로 사용됩니다.

이벤트를 수집하기 시작하고 전방 산란(forward scatter) 및 내부 산란(inside scatter) 선형 신호를 조정하십시오. 세포군을 명확하게 시각화하려면, x축이 전방 산란인 플롯의 하단 중앙 부근에 세포가 위치해야 합니다. 핵 염색 시약인 PI는 세포막 투과성이 없으므로, 살아있는 세포에서는 배제될 것입니다.

PI 히스토그램에서 PI 양성 사멸 세포에 게이트 영역을 지정하십시오. 기기 소프트웨어에서 이 게이트 내의 사멸 세포를 빨간색으로 표시하도록 설정하십시오.

색상으로 표시된 사멸 세포를 가이드로 사용하여 숙주 G0 G1 집단을 식별하는 것이 유용합니다. PI 염색 역시 UV 레이저에 의해 여기되므로, 대부분의 사멸 세포는 측정 범위를 벗어나 나타나야 합니다. 적색 대 청색 가상 형광 플롯의 우측에서, 골수의 G0 G1 집단이 적색 대 청색 가상 플롯 상의 조밀한 이벤트 군집으로 관찰되어야 합니다.

검출기 전압을 조정하여 G zero G one 클러스터가 플롯의 중앙 상단 우측에 위치하도록 합니다. 세포 주기의 S-phase 일부와 G two 전체가 스케일을 벗어날 수 있습니다. 적색 대 청색 hoaxed 플롯의 상단 우측에서, side population hosts low가 G zero G one 클러스터의 왼쪽 면에서 시작하여 플롯의 왼쪽 하단 모서리까지 이어지는 모습이 관찰될 것입니다.

이제 FSC 대 SSC 산점도에서 세포 군집 주위에 게이트를 설정하십시오. 더블렛 플롯에서 확인된 싱글렛 집단과 PI 히스토그램의 생존 세포를 플롯하십시오. 그런 다음, 이 게이트된 집단들만 표시되도록 hoax 플롯을 지정하십시오.

호스트 플롯의 게이팅을 마친 후, 사이드 팝퓰레이션(side population) 주변에 영역을 지정합니다. 이 영역을 라이트 스캐터 싱글렛(light scatter singlet) 및 생존 세포 게이트와 함께 CD 45 A PC 히스토그램의 게이트로 설정합니다. 시스템 설정이 완료되면, 로딩 포트에서 샘플을 제거하고 폐 샘플을 로딩 포트에 넣습니다.

이 샘플에 대해서는 기기 설정을 다시 조정할 필요가 없습니다. red versus blue hoax 플롯에서 이벤트 수집을 시작하십시오. 폐 샘플의 G zero G one 클러스터는 일반적으로 x축 방향으로 더 길게 나타나며 키보드의 물결표(~) 기호와 유사한 형태를 띱니다.

사이드 팝플레이션(side population) 게이트 하단은 골수 샘플에 설정한 것과 유사한 위치에 있어야 합니다. 사이드 팝플레이션의 정밀한 분해능을 확보하기 위해 상하로 약간의 조정이 필요할 수 있습니다. 샘플 흐름 밸브가 너무 많이 열리지 않도록 하여 소팅 중 낮은 압력 차를 유지하십시오.

MSC를 분리하기 위해 96-well 수집 플레이트를 소팅 챔버에 배치하고, CD 45 A PC 히스토그램에서 소팅 게이트를 설정하여 양성 및 음성 집단을 분리합니다. 마지막으로, 세포를 튜브에 혼합 집단으로 수집하거나 96-well 플레이트에 단일 세포로 수집하여 클론을 분리합니다. 세포 소팅을 통해 폐 MSC를 수집한 후, 20% FBS가 첨가된 α-MEM을 사용하여 30mm 디시에 세포를 플레이팅합니다. 우선, 소팅된 세포는 약 2~3주 후에 작고 둥글며 밝게 나타납니다.

중간엽 표현형을 가진 콜로니가 나타나며, 각 세포 준비물에서 증식이 더욱 뚜렷해집니다. 폐 MSC가 전통적인 중간엽 계통인 조골세포, 지방세포 및 연골세포로 분화하는 능력과 공인된 중간엽 마커의 세포 표면 발현을 평가하십시오. 거시적인 염색체 이상이 없는지 확인하기 위해 세포유전학적 밴딩 분석을 수행하십시오.

유세포 분석을 통한 분리와 단일 세포 클론 생성을 마친 후, MSC 세포의 특성과 분화 능력을 분석하기 위해 콜로니 형성 분석(colony forming assay)을 수행합니다. 밀리리터당 3×10⁴개의 세포로 희석된 상태에서 시작하십시오. 100 mm 디쉬 내의 불완전 배양 배지에서, 디쉬당 10 mL의 배지를 사용하여 2.6×10⁴, 3×10⁴, 1.5×10⁴, 0.75×10⁴개의 세포 농도로 단계별 희석을 3반복으로 수행합니다.

그 다음 10일간 배양한 후 플레이트를 인큐베이터에서 꺼내어 배지를 따라내고 PBS로 세포를 세척합니다. 이어서 상온에서 100%methanol을 5분간 첨가하여 세포를 고정합니다. 5분 후, methanol을 따라냅니다.

그 다음 콜로니 형성을 검출하기 위해, 이온수로 1:20으로 희석한 0.4% weight by volume gza를 첨가하고 10~15분 동안 배양합니다. 이후 염색약을 따라내고 이온수로 헹굽니다. 시료를 공기 중에서 건조시킨 후, 도립 현미경 또는 시각화 장치를 사용하여 콜로니당 세포 수가 25개 이상인 콜로니의 수를 정량화합니다.

여기에 나타난 바와 같이 콜로니는 수백 개의 세포로 구성된 크기가 큰 형태이며 중간엽 표현형을 보입니다. 이 비디오에 제시된 것처럼 MSC를 분리하여 96-웰 플레이트에 도말해 성장을 유도했습니다. 그 후, CFSE로 표지되어 정지된 항원제시세포를 폐 MSC에 추가했습니다.

그 후 분리된 MSC의 증식은 배경값(이 그림에 표시된 것과 같이 CFSE로 표지된 T 세포 단독) 대비 CFSE의 평균 형광 강도 감소로 측정하였습니다. 폐 SC가 없고 항원 제시 세포가 있는 상태에서, APC와 OVA 알부민 및 CD40 양성 이펙터 T 세포가 함께 있을 때 CFSE 강도가 감소하며, 이는 빨간색 원으로 표시된 증식을 나타냅니다. T 세포 막의 CFSE 형광 강도는 세포 분열이 일어날 때마다 기하급수적으로 감소하며, 즉 분열 시마다 절반으로 줄어듭니다. 폐 MSC, APC 및 OVA CD40 양성 이펙터 T 세포가 함께 있는 경우에는 CFSE 강도에 유의미한 변화가 나타나지 않았으며, 이는 증식이 일어나지 않았음을 의미합니다. 이러한 기술은 폐 줄기세포 생물학 분야의 연구자들이 폐동맥 고혈압 및 폐섬유증과 같은 폐 질환에서 중간엽 줄기세포의 역할을 탐구할 수 있는 길을 열어주었습니다.

이 기술을 숙달하면 본 절차에 따라 약 5시간 이내에 완료할 수 있습니다. 추정되는 폐 간엽줄기세포가 뼈, 지방 및 연골로의 적절한 다분화 능력을 나타내는지 여부를 포함하여 추가적인 질문에 답하기 위해 분화 분석과 같은 다른 방법을 수행할 수 있습니다.