Autologous 내피 전구 세포 - 심는 기술 및 대형 동물 모델에서 순환기 장치에 대한 Biocompatibility 테스트

본 실험의 전반적인 목표는 혈관 임플란트에 자가 혈액 유래 내피 전구 세포를 파종한 후, 대동물 모델에서 이러한 처치가 혈전 형성에 미치는 영향을 관찰하는 것입니다. 이를 위해 돼지의 말초 혈액 샘플을 채취하여 후기 성장 돼지 내피 전구 세포를 분리합니다. 그다음으로, 이식 가능한 장치를 준비합니다.

본 개념 증명 연구의 티타늄 튜브에는 자가 PC가 안착되어 있습니다. 이후 이 장치를 돼지의 하대정맥에 이식합니다. 결과에 따르면, 대조군 및 폐쇄된 베어 메탈 튜브와 달리 EPC가 안착된 티타늄 튜브의 개통성을 통해 혈전증에 대한 보호 효과가 있음이 나타났습니다.

Duke surgery는 획기적이고 혁신적인 연구를 육성하는 데 전념하고 있습니다. 다음 발표는 의학 발전을 위해 우리가 어떻게 여러 학과와 학제 간 협업을 수행하는지를 보여주는 한 가지 사례입니다. EK 박사는 혈관 장치의 혈액 접촉 표면을 환자 자신의 전구세포로 코팅하여 혈전증을 예방하는 세포 시팅(cell seating) 기술을 개발하는 연구를 이끌어 왔습니다.

이 세포들은 임플란트를 이식받을 환자와 동일한 환자로부터 유래되었으므로, 면역 체계에 의한 거부 반응을 피할 수 있습니다. 본 연구의 성과와 여기에 기술된 방법들은 대규모 팀의 협력 결과입니다. 외과적 이식 과정은 혈관 외과 섹션의 Sean Gage와 듀크 대학교 의대생인 Whitney Lane, 그리고 본 연구자가 시연하겠습니다.

이제 의생명공학과 박사 과정생인 Alexander Janssen 씨를 소개하겠습니다. Janssen 씨가 세포 시딩 과정을 자세히 안내해 드릴 것입니다. 저는 돼지 모델에 이식하기 직전에 티타늄 튜브에 혈액 유래 내피 전구 세포를 시딩하는 방법을 시연하겠습니다. 이 방법은 개념 증명 역할을 하며, 동일한 기본 원리를 니티놀 스텐트 및 기계적 순환 보조 장치와 같은 다른 많은 이식 가능 장치에 적용할 수 있습니다. EPC는 돼지 혈액의 단핵구 세포 분획을 도말하여 분리하며, 보통 약 7일 후에 나타납니다.

이들은 전형적인 자갈 모양(cobblestone)의 형태학적 특징으로 식별할 수 있습니다. 배양된 EPC를 총 900만 개의 세포 수가 될 때까지 증식시킵니다. 준비된 EPC를 무혈청 배지로 두 번 헹구며, 라벨링 도중 및 이후에 빛에 노출되지 않도록 주의하십시오.

그런 다음 형광 라벨인 PKH 26으로 세포를 덮고, 적용된 용액의 양을 기록합니다. 세포를 상온에서 4분 동안 배양합니다. 1분 후, 염료 용액에 동일한 부피의 돼지 혈청을 첨가하여 라벨링 반응을 중단시킵니다.

혼합된 용액을 완전 성장 배지로 1:1 비율로 희석합니다. 그런 다음 액체를 흡입하여 제거하고, 완전 성장 배지로 세포를 3회 헹군 뒤, 칼슘 또는 염화마그네슘이 포함되지 않은 DPBS로 2회 세척합니다. 이어서 사용한 부피를 기록하며 세포가 trypsin에 잠기도록 덮어준 후 37 °C에서 배양합니다.

3분간 배양한 후, 현미경을 사용하여 세포가 탈락했는지 확인하고, 탈락했다면 첨가한 양의 두 배에 해당하는 트립신 중화 용액을 추가합니다. 트립신 처리 후, 세포 용액을 하나의 튜브에 합치고 혈구계수기로 세포 밀도를 측정합니다. 마지막으로, 세포 현탁액을 원심 분리하여 펠렛화하고, 최소 4.5 milliliters의 무혈청 배지에 세포를 재현탁합니다.

수술을 위해 돼지를 준비시킨 후, 두 번째 유선부터 15번 메스 날을 사용하여 정중선을 절개하십시오. 전기소작기를 사용하여 끝에서 두 번째 유선까지 조심스럽게 절개해 나갑니다. 복막 근막까지 박리를 진행하십시오.

모스키토 포셉으로 복막을 들어 올리고 메츠 가위로 조심스럽게 절개하여 방광을 외부로 노출시킨 후, 방광벽에 3-0 Vicryl을 이용해 주머니 봉합(purse string suture)을 시행합니다. 봉합사 중심부에 작은 절개를 넣고 16 French Foley 카테터를 삽입합니다. 그 다음, 수술 중 소변량이 시간당 킬로그램당 최소 1mL가 되도록 정맥 수액을 투여하여 조절합니다.

다음으로, 확장된 소장을 외부로 노출시키고 두 개의 bour 외과용 견인기를 배치하여 복강의 후면을 노출시킨 뒤, 예리한 박리와 둔적 박리를 통해 IVC를 식별합니다. 주변 조직으로부터 IVC를 조심스럽게 분리합니다. 그런 다음 IVC 분기점의 원위부에서 우측 신동맥까지 혈관을 골격화합니다.

IVC 해부 시 매우 세심한 주의가 필요합니다. IVC에 아주 작은 결함만 생겨도 급격한 출혈과 동물의 과다출혈로 이어질 수 있기 때문입니다. IVC 분절의 모든 측분지들을 결찰하십시오. 특히 IVC 분기점 바로 근위측에 위치한 두 개의 큰 후요정맥을 해부하고 결찰할 때 특별히 주의하십시오. 후측에 큰 요정맥이 존재하는 경우가 많습니다.

이 정맥을 주변 조직과 분리하여 박리한 후 혈관 루프로 고정합니다. 이제 수술과 병행하여, 본 절차를 시작하기 전에 임플란트에 EPC를 파종하기 시작합니다. 티타늄 튜브 조직 안착 스캐폴드는 완전히 조립되어 멸균 구역 내에서 사용할 준비가 되어 있어야 합니다.

가스 멸균된 티타늄 튜브 어셈블리를 5 cc 주사기에 넣습니다. 그다음 5 cc 주사기에서 플런저를 제거하되, 버리지 말고 주사기에 고정된 캡을 씌워 둡니다. 피펫을 사용하여 주사기에 EPC 현탁액을 채웁니다.

그런 다음 플런저를 다시 끼웁니다. 캡을 제거하고 시린지의 루어 끝부분을 어셈블리의 개방된 실리콘 튜브에 딱 맞을 때까지 삽입합니다. 더 이상 삽입하지 말고, 세포 용액을 헤드피스 상단까지 천천히 밀어 올려 기포를 제거합니다.

그 다음 루어 캡으로 조립체를 닫고 멸균 장갑을 낀 상태에서 테이프로 밀봉합니다. 이 조립체 전체를 가공된 시린지 홀더에 삽입하고 37 °C 인큐베이터에 넣습니다. 게이지를 사용하여 시팅 챔버의 수평을 맞추고, 조립체를 천천히 회전시키며 배양합니다.

하대정맥(IVC)을 결찰한 직후, 돼지 체중 1kg당 100단위의 헤파린을 투여하여 수술을 계속합니다. 그런 다음 하대정맥과 요정맥의 원위부와 근위부를 45도 각도로 즉시 클램프로 고정합니다. 이어서 11번 메스 날과 포트 가위를 사용하여 근위부와 원위부 클램프 사이에 4cm 길이의 종방향 정맥 절개술을 시행합니다.

IVC 내의 혈액을 모두 제거하고 멸균된 DPBS로 내강을 세척합니다. 이제 세포가 건조되는 것을 방지하고 공기를 제거하기 위해 EPC가 안착된 임플란트 또는 베어 메탈 대조군을 IVC에 삽입합니다. IVC를 염화칼슘과 염화마그네슘이 포함된 DPBS로 채웁니다.

그다음 4-0 prolen 연속 봉합사로 정맥 절개부를 폐쇄하고, 근위측 클램프 하나를 제거하여 소량의 역혈을 통해 IVC 내의 공기를 제거합니다. 출혈 후, 임플란트를 제자리에 유지하기 위해 원위측 클램프를 제거합니다. 정맥벽을 통과하는 PVC 튜브에 고정 봉합사를 적용합니다.

CT 바늘에 끼운 OPDS를 사용하여 근막을 봉합합니다. 2-0 Vicryl을 이용해 피하 공간을 연속 봉합합니다. 그런 다음 피부 스테이플러로 피부를 봉합합니다.

절개 부위를 따라 0.25% Marcaine을 최대 20 milliliters까지 피하 투여하고, 통증 완화를 위해 상처 부위를 거즈와 tegaderm으로 덮어줍니다. 필요에 따라 flu Nixon과 oxymorphone을 피하 투여합니다. 마취를 중단하고 돼지가 깨어나면 향후 7일 동안 케이지로 돌려보냅니다.

항생제 예방 조치로 24시간마다 atri를 투여하고, 수술 전 부착한 fentanyl 패치가 총 3일 동안 잘 부착되어 있도록 합니다. 3일 후, 매립된 티타늄 튜브 임플란트를 제거하고 내부 표면을 검사했습니다. 550 nanometer 여기 파장에서, 다른 튜브 내에 형광 표지된 세포들이 밀집된 층을 형성하고 있는 것이 확인되었습니다.

세포 경계를 시각화하기 위해 절편 세포를 혈소판 내피 세포 접착 마커로 추가 염색하였습니다. 이 과정에는 매우 다양한 염색법을 사용할 수 있습니다. 이와 대조적으로, 아무런 처리를 하지 않은 티타늄 튜브 임플란트는 하대정맥의 혈전 형성 가능성이 높은 저전단 환경에서 완전히 폐색됩니다.

이미지 A와 C에 나타난 바와 같이, 세포가 안착된 티타늄 튜브는 이미지 B에 제시되어 있으며 혈전이 생성되지 않은 상태로 유지되었습니다. 돼지 혈액을 이용한 당사의 분리 절차 이후, 배양 7일 평균 시점에 EPC가 나타납니다. 수술 절차를 수행할 때 IVC를 조심스럽고 부드럽게 박리하는 것이 매우 중요한데, 이는 IVC나 그 분지에서 아주 작은 찢어짐만 발생해도 돼지의 과다출혈로 이어질 수 있기 때문입니다. 이 절차 이후, 다른 혈액 접촉 재료들은 혈전 형성을 방지하기 위해 빠르게 내피화될 수 있습니다.

예를 들어, 당사의 EPC를 이용한 혈관 내피 스텐트는 혈관벽의 천연 내피층을 모방하여, 시술 후 스텐트 재협착 및 혈전 형성을 방지할 수 있습니다. 당사의 quick see 기술을 통해 수술실이나 카테터 삽입실에서 단 몇 분 만에 환자의 혈액 유래 혈관 내피 전구세포로 혈관 내 장치의 내피를 형성할 수 있습니다. 따라서 장기간의 ex vivo 배양이 필요하지 않습니다.

장치 자체에서의 체류 시간을 최소화함으로써, 이 기술은 임상 실무로 전환하기 위한 실용성을 갖추게 됩니다.