부정적 얼룩 EM에 의해 단백질과 Macromolecular의 단지를 떠올리 : 그리드 준비에서 이미지 수집

이 실험의 전체적인 목적은 음성 염색 전자 현미경법을 통해 정제된 단백질 샘플을 시각화하는 것입니다. 이를 위해 먼저 샘플을 지지할 전자 현미경 그리드를 준비합니다. 그다음 단계로 음성 염색 용액을 조제합니다.

다음으로, 시료를 전자현미경 그리드에 도포하고 음성 염색을 수행합니다. 마지막으로, EM 그리드를 전자현미경에 장착하고 적절한 광학 조건에서 이미지를 기록합니다. 일반적인 명시야 DEM 이미지는 대비가 높고 세부 묘사가 뚜렷하여, 특징 없는 배경 위에 흩어져 있는 단일 거대분자를 보여줍니다.

음성 염색 전자 현미경법은 특정 단백질을 시각화하는 간단한 방법입니다. 이 방법은 정제된 단백질의 구조 분석이나 기타 생화학 및 생물물리학적 분석을 위한 일상적인 분석법으로 활용될 수 있습니다. 본 영상에서는 전자 현미경 관찰을 위한 음성 염색 시료 준비 방법을 설명합니다.

일부 단계는 텍스트 설명과 도식만으로는 습득하기 어렵기 때문에, 이 방법의 시각적 시연이 도움이 됩니다. 먼저 유리 피펫을 사용하여 수면 위에 콜로디온 한 방울을 떨어뜨려 큰 비커의 물 표면에 놓습니다. 콜로디온이 퍼지면서 수면의 먼지를 포집할 수 있습니다.

먼지가 앉은 콜로디온 플라스틱 막을 제거하고 다른 한 방울로 교체합니다. 다음으로, 50~100개의 EM 그리드를 반짝이는 면이 아래로 향하게 하여 떠 있는 플라스틱 막 위에 하나씩 올립니다. 일반적인 음성 염색에는 400 mesh 그리드를 선택하고, 200 mesh 그리드를 선택합니다.

틸트 쌍(tilt pair) 이미지를 수집하기 위한 단계입니다. 그리드 면적보다 약간 더 큰, 구김이 없고 흡수 속도가 느린 종이를 준비합니다. 종이를 그리드 위에 올리고 종이가 완전히 젖을 때까지 기다립니다.

종이가 물을 너무 빨리 흡수해서는 안 됩니다. 저렴한 메모장의 종이를 사용합니다. 이제 그리드는 플라스틱 필름과 종이 사이에 끼워진 상태가 됩니다.

포셉을 사용하여 페이퍼를 페트리 접시에 놓고 천천히 자연 건조시킵니다. 더 빠른 건조 방법은 주름을 유발할 수 있으므로 피하십시오. 본 실험실에서 사용한 카본 코팅기는 Creston 2 0 8 C 고진공 터보 카본 코터입니다.

Creston 박막 두께 모니터가 장착되어 있습니다. 이 모니터는 탄소 증착에 민감한 수정 진동자(quartz balance)를 사용합니다. 하지만 본 프로토콜에서는 이 장치가 필요하지 않습니다. 탄소 코팅기에서 탄소 막대를 연마하고 장착하는 것으로 시작하십시오.

다음으로, 프로스티드(frosted) 영역의 절반을 제외한 나머지 부분에 진공 그리스를 바른 유리 슬라이드를 코팅합니다. 탄소 코팅 후, 슬라이드의 그리스가 발라진 영역을 통해 탄소 코팅 층의 두께를 추정합니다. 그리드가 그려진 종이를 탄소 코팅기의 벨 자(bell jar) 아래 스테이지에 놓습니다. 그 위에 그리스를 바른 유리를 배치합니다.

그리드 옆으로 슬라이드를 이동시키십시오. 진공 챔버를 최소 10 micro tours까지 펌핑하십시오. 그렇지 않으면 스파킹으로 인해 그리드에 많은 대형 입자가 생성될 수 있습니다. 이제 전류를 매우 천천히 높이십시오.

탄소봉의 뾰족한 끝부분이 매우 밝게 빛나게 됩니다. 코팅이 시작될 때 이를 맨눈으로 관찰하지 마십시오. 탄소 코팅이 형성됨에 따라 유리 슬라이드의 색상이 진한 회색으로 변하며, 원하는 탄소 두께에 도달했을 때 전류를 차단하십시오. 이때 벨 자(bell jar)의 투명도를 고려해야 합니다. 이러한 판단 기준을 세울 때, 슬라이드의 어두운 정도를 탄소 두께에 맞춰 보정해 두면 이 방법은 고가의 박막 두께 측정기만큼 정확합니다.

공정이 완료되면 진공 챔버를 벤팅하고 코팅된 그리드를 꺼내어 나중에 사용하십시오. 얇은 플라스틱 층은 음성 염색 이미지의 품질에 영향을 주지 않지만, 진행하기 전에 그리드를 클로로포름에 몇 시간 동안 담가 제거할 수 있습니다. 신선한 urin L formate 용액을 조제하거나 암소에 2주 미만으로 보관된 용액을 사용하십시오.

상태가 좋은 신선한 용액은 노란색을 띠며, pH는 약 4 정도이고 침전물 없이 매우 깨끗하게 흐릅니다. 먼저 상용 시스템을 사용하여 글로우 방전을 실시하십시오. 탄소 코팅 그리드를 방전시킵니다.

다음으로, 증류수 20 µL 방울 두 개와 신선한 요중 포름산 용액(urinal formate solution) 25 µL 방울 두 개를 파라필름 조각 위에 떨어뜨립니다. 역방향 힘 항모세관 핀셋(reverse force anti capillary forceps)을 사용하여 글로우 방전된 그리드의 탄소 코팅면이 위로 오도록 잡습니다. 중요한 점은, 이 핀셋은 그리드에서 액체를 빨아들이지 않는다는 것입니다.

이제 2 µL의 단백질 시료를 그리드에 도포하고 단백질이 그리드에 흡수될 때까지 기다립니다. 이 과정은 보통 30초가 소요되지만, 매우 희석된 시료의 경우 더 많은 시간이 필요하며 이는 버퍼 농도에 영향을 줄 수 있습니다. 작업이 끝나면 여과지로 단백질 시료를 닦아냅니다.

그 다음, 그리드 표면을 물 한 방울에 잠시 접촉시킨 후 몇 초 내에 닦아내어 이 과정을 두 번 반복하여 세척합니다. 물 세척 후, 그리드를 염색액 한 방울에 잠시 접촉시킨 뒤 빠르게 닦아냅니다. 동일한 방법으로 그리드를 두 번째 염색액 방울에 20초 동안 접촉시킵니다.

마지막으로, 벤치형 흄 후드 내에서 그리드를 공기 건조시키거나, 가급적이면 EM 세션 전에 진공 상태에서 건조시키십시오. EM 현미경의 정렬 상태를 확인하고, 사용 가능한 경우 최적화된 정렬 파일을 로드하면 거의 완벽한 상태로 복구될 것입니다. 이제 단일 틸트 표준 시료 홀더에 EM 그리드를 장착하십시오. 다음으로, 홀더를 스테이지에 삽입하십시오.

그 다음 펌핑 사이클이 완료될 때까지 기다린 후 홀더를 컬럼에 삽입하십시오. 이제 염색 상태가 좋은 샘플 영역을 찾기 시작하십시오. 최소 대비법을 사용하거나 CC, D 카메라를 사용하여 라이브 포(live four)를 계산함으로써 수동으로 초점을 맞추십시오.

전력 스펙트럼을 확인하십시오. 그런 다음 필요에 따라 딥 포커스(deep focus)를 설정하며, 일반적으로 -1.5 µm로 설정합니다. 그리드 전체에서 염색 농도가 다를 수 있으므로, 흰색 대비가 나타나는 단백질을 찾으십시오.

단백질 대비가 검게 나타나는 염색 불균일 영역이나 양성 염색 영역은 피하십시오. 그리드를 제작하고 음성 염색된 시료를 시각화하기 위해 개괄된 접근 방식을 사용합니다. 시연 목적으로 몇 가지 친숙한 단백질들을 촬영하였습니다.

세부 사항과 선명한 대비를 확인하십시오. 이 영상을 시청하고 나면, 전자 현미경 관찰을 위한 음성 염색 거대분자 샘플을 제조하는 방법에 대해 충분히 이해하게 될 것입니다. 이 기술을 숙달하면 약 4시간 만에 수행할 수 있습니다.

이 절차를 마친 후, 분자 구조를 더 잘 이해하기 위해 3D 재구성(3D reconstruction)과 같은 다른 방법들을 수행할 수 있습니다.