리그노셀룰로오스성 자료에 대한 높은 처리량 당화 분석

안녕하세요, 저는 Kara Ted이고, 저는 Leo입니다. 반갑습니다. 그리고 저는 Simon McQueen Mason입니다.

식물 바이오매스의 소화율은 현재 매우 큰 관심을 끌고 있는 주제입니다. 이는 바이오매스를 구성하는 식물 세포벽의 다당류에 많은 당이 결합되어 있으며, 이러한 당을 이용 가능한 형태로 추출할 수 있다면 이를 발효시켜 연료 및 화학 물질과 같은 다양한 제품을 생산할 수 있기 때문입니다. 불행히도 이러한 물질들은 소화시키기가 매우 어려우며, 소화율을 결정짓는 요인에 대해 더 깊이 이해하는 것이 시급한 과제입니다.

따라서 재생 가능 그룹 생산에 식물 재료를 사용하기 위해서는, 이러한 식물들의 당화 잠재력을 측정할 수 있어야 합니다. 이에 따라 이곳 요크 대학교에서는 식물 재료의 대규모 집단을 스크리닝하여 그 당화 잠재력을 결정하고 있습니다. 당화는 다양한 산업 공정을 통해 가치 있는 화학 물질을 생산하기 위해 복잡한 탄수화물을 단당류 성분으로 분해하는 과정입니다.

당화 가능성을 측정하기 위해, 우리는 바이오매스에 전처리와 효소 가수분해를 적용하여 방출되는 당의 양을 결정하는 마이크로 스케일 수준의 산업 공정을 재현합니다. 이를 통해 유전자형 중 흥미로운 품종을 식별합니다. 이 고처리량 시스템은 IG 6-웰 플레이트 형식으로 작동합니다.

유전자형 간의 미세한 차이를 드러내기 위해 완만한 조건의 가수분해가 사용되며, 이는 다양한 기질 재료를 지원하고 서로 다른 효소를 평가하기에 충분히 유연합니다. 본 연구에서 사용하는 방법은 식물 재료를 분말 형태로 가공한 후, 90 °C에서 20분 동안 희석된 산 또는 알칼리로 전처리하는 과정을 포함합니다. 이어서, 상용 셀룰레이스 혼합물을 사용하여 50 °C에서 8시간 동안 효소 소화를 수행합니다.

마지막으로, MBTH 방법을 사용하여 환원당의 방출량을 측정합니다. 식물 재료는 건조된 줄기 형태로 수확하며, 이를 4 mm 길이의 세그먼트로 절단합니다. 절단된 세그먼트들을 5 mm 금속 볼 3개와 함께 2 mL 바이알에 넣습니다.

바이알에는 바코드가 개별적으로 부착되어 있으며, 샘플의 추적성을 확보하기 위해 이를 스캔합니다. 샘플은 분쇄 및 포맷팅 로봇에 로드됩니다. 샘플은 자동으로 분쇄 및 혼합되어 바이오매스가 96-웰 플레이트에 분주될 수 있도록 합니다.

바이알의 뚜껑을 뚫은 후, 바이알을 로봇 암의 위치를 조정하여 분말을 분사하기 위해 진동하는 깔때기 안에 놓습니다. 깔때기의 진동은 웰당 분사되는 목표 질량을 달성하기 위해 저울로 조절됩니다. 바이오매스는 플레이트의 10개 컬럼에 분사하며, 표준 시료를 위해 2개 컬럼을 남겨둡니다.

샘플당 4회 반복 실험을 수행하여, 플레이트당 20개의 샘플을 로딩합니다. 이 플레이트의 가수분해물을 PCR 플레이트에 3분할 하여 총 3개의 광학 플레이트를 만듭니다. 이러한 방식으로, 바이오매스 웰당 환원당에 대해 3회의 측정값을 얻게 됩니다.

포맷팅이 완료되면, 증발을 방지하기 위해 플레이트를 실리콘 매트로 밀봉합니다. 준비가 되면 액체 핸들링 로봇으로 이동시킵니다. 액체 핸들링 로봇을 통해 전처리, 효소 가수분해 및 방출된 당의 정량이 자동으로 수행됩니다.

2미터 길이의 테이블에는 필요한 다양한 시약용 용기와 플라스틱 소모품 보관 공간이 마련되어 있습니다. 전처리와 가수분해를 위한 인큐베이터와 당 정량을 위한 써모사이클러가 구비되어 있습니다. 전처리는 딥웰 플레이트에서 수행합니다.

희석된 산성 또는 알칼리성 용액을 바이오매스 분말에 첨가합니다. 플레이트를 가열 블록으로 옮겨 90 °C에서 20분 동안 배양합니다. 배양이 완료되면 500 µL의 아세테이트 버퍼로 5회 세척하여 전처리를 제거합니다.

전처리를 헹군 후, 효소 칵테일을 첨가합니다. 이는 표준 혼합물입니다. 여기에는 cellulose와 novozyme 1, 8 8이 4:1 비율로 포함되어 있으며, 농도는 웰당 7 FPU입니다.

플레이트를 50 °C에서 8시간 동안 흔들어주며 배양합니다. 결과물인 가수분해액 75 µL를 PCR 플레이트로 옮깁니다. PCR 플레이트의 11번과 12번 컬럼에는 포도당 표준물질을 첨가합니다.

다음으로 모든 웰에 1 M sodium hydroxide 25 µL를 첨가합니다. 마지막으로 MBTH 시약 50 µL를 PCR 플레이트에 피펫팅합니다. 가수분해물을 세 번째 PCR 플레이트로 모두 옮긴 후 딥 웰 플레이트를 보관합니다.

PCR 플레이트를 써모사이클러로 옮겨 60°C에서 15분 동안 배양합니다. 공정의 마지막 단계는 색상 발색을 위해 반응 혼합물을 광학 플레이트로 옮기는 것입니다. 배양이 완료되면 PCR 플레이트를 써모사이클러에서 꺼냅니다.

전이된 반응 혼합물에 100 µL의 산화제가 첨가됩니다. 발색을 촉진하기 위해 액체 핸들링 프로세스가 24시간 동안 4회 실행되며, 전처리 세척 및 효소 첨가에는 약 2시간이 소요됩니다. 효소 가수분해에는 8시간이 소요되며, 당 정량 분석에 추가로 2시간이 소요됩니다.

첫 번째 플레이트가 8시간 동안 배양되는 동안, 다음 플레이트의 공정이 시작됩니다. 이러한 로봇 자원 배분을 통해, 방출된 환원당의 양을 결정하기 위해 하루 80개 샘플의 3배 처리량(throughput)을 달성합니다. 광학 플레이트는 620 nanometers에서 측정됩니다.

얻어진 결과는 반응 시간당 밀리그램당 나노몰(nanomoles per milligram per hour)로 방출된 당의 양을 정량화하여 분석합니다. 시청해 주셔서 감사드리며, 본 영상이 여러분의 바이오 연료 연구에 도움이 되기를 바랍니다.