시토크롬를 사용 Mitochondrial 호흡 기능의 시각화 C 데이스 / 호박산 탈수소 효소 (COX / SDH)를 두 번 라벨 Histochemistry

본 절차의 전반적인 목적은 신선 동결 조직 절편에서 미토콘드리아 호흡 효소 결핍을 직접 시각화하는 것입니다. 이는 먼저 관심 기관의 크라이오스탯 절편을 수집함으로써 수행됩니다. 절차의 두 번째 단계는 Cox 조직 화학 염색을 수행하는 것이며, 이어서 SDH 조직 화학 염색을 진행합니다.

마지막으로, 조직 절편을 탈수하고 봉입한 후 커버글라스를 덮습니다. 최종적으로, 세포의 청색 염색 정도를 통해 미토콘드리아 기능 장애의 정도를 확인할 수 있습니다. 안녕하세요. 오늘은 Cox 및 SDH 이중 표지 조직화학적 기법에 대해 알아보겠습니다.

또한 이 방법은 미토콘드리아 질환 연구에 적용될 수 있을 뿐만 아니라, 노화 및 노화 관련 질환에 대한 통찰을 제공할 수 있습니다. 윤리적 허가에 따라 희생시킨 동물의 뇌를 적출한 후, 드라이아이스 위에서 빠르게 동결하십시오. 동결된 조직은 섹셔닝 준비가 될 때까지 알루미늄 호일로 감싸 -80 °C에서 보관할 수 있습니다.

뇌 조직을 크라이오스탯 척(cryostat chuck) 위에 놓고 매립 화합물로 둘러싸서 동결 절편 제작을 위해 준비합니다. 척을 신속하게 크라이오스탯 내부로 옮겨 -21 °C에서 14 micron 두께의 절편을 수집합니다. 가열 블록을 사용하여 절편을 슬라이드 위에 해동시킨 후, 상온에서 1시간 동안 슬라이드를 건조시킵니다.

젖은 종이 스트립이 있는 슬라이드 염색 챔버에 슬라이드를 넣습니다. 이 분석법에서는 반응 시간이 중요하므로, 화학 흄후드 아래에서 실험당 최대 10개의 슬라이드만 처리하는 것이 권장됩니다. PBS 내의 dab 및 cytochrome C를 포함하는 배양 배지를 준비하고 볼텍싱합니다.

2 µg의 소 CDE를 배지에 빠르게 넣고 볼텍싱하여 잘 섞어줍니다. 후드 내에서 작업을 계속하며, CDE 입자를 모두 분산시키기 위해 피펫 팁을 사용하여 각 슬라이드에 150~200 µL의 배양 배지를 넣고 모든 구역에 고르게 펴 바릅니다. 슬라이드를 37 °C에서 40분 동안 배양합니다.

40분 후, 슬라이드에서 배양 배지를 제거합니다. PBS로 각 10분씩 총 4회 슬라이드를 세척합니다. 세척 후, 화학 흄후드 내에서 젖은 종이 스트립이 들어 있는 슬라이드 염색 챔버로 슬라이드를 다시 옮깁니다.

PMS가 빛에 노출되지 않도록 주의하며 PBS에 NBT 용액을 준비하고, 용액을 빠르게 볼텍싱합니다. 피펫 팁을 사용하여 NBT 용액 150~200 µL를 각 슬라이드에 도포하고 모든 섹션에 고르게 펴 바릅니다. 슬라이드를 37 °C에서 40분 동안 배양한 후, 40분이 지나면 슬라이드에서 과잉 용액을 제거합니다. 슬라이드를 PBS로 10분씩 4회 세척합니다.

다음의 에탄올 농도 순서대로 각 2분씩 슬라이드를 탈수시킵니다: 70%, 70%, 95%, 95% 그리고 99.5%. 마지막으로, 추가적인 99.5% 단계에서 10분 동안 둡니다. 슬라이드를 자일렌(xylene)에 10분 동안 넣은 후 LAN으로 마운팅하고 커버슬립을 덮습니다.

슬라이드를 환기가 잘 되는 곳에서 하룻밤 또는 최소 1~2시간 동안 건조하십시오. 야생형 및 조기 노화 MT.DNA Mutator 마우스의 뇌 절편을 사용하여 COX 및 SDH 활성을 순차적으로 염색하였습니다.

야생형 생쥐의 해마에서는 진한 갈색 염색으로 나타나는 정상적인 Cox 활성이 관찰되었습니다. 12주 및 46주령의 MT DNA mutator 생쥐 해마에서는 파란색 염색으로 나타나는 Cox 결핍이 확인되었습니다. M-T-D-N-A mutator 생쥐의 경우 46주령에 Cox 활성이 더욱 감소하였으며, 이는 호흡 연쇄 기능 장애가 광범위하게 악화되었음을 시사합니다.

10분 및 25분의 불충분한 배양 시간으로 인해 갈색 DAB 반응 생성물의 침전이 감소하였습니다. 배양 시간이 단축됨에 따라 SDH 배양 중에 청색 Foran 최종 생성물이 형성되었으며, 이는 COX 결핍 세포가 존재한다는 오해를 불러일으켰습니다. 또한 COX 배양 중 슬라이드 덮개 유리(cover slipping) 과정의 문제는 DAB 반응 생성물의 부정확한 형성과 침전으로 이어졌습니다.

Cox 및 SDH 활성은 여기서 보여주는 것처럼 개별적으로 염색할 수 있지만, 순차적 염색이 미토콘드리아 기능 장애가 있는 세포를 찾는 데 더 유리한 것으로 입증되었습니다. 야생형 생쥐 뇌에서의 COX 및 SDH 활성에 대한 특이성 대조군 예시는 음성 염색 결과를 보여줍니다. 따라서 Cox SCH 이중 염색에 사용되는 화학 물질과 화학 프로토콜은 매우 위험하므로, 이 분석을 수행할 때마다 적절한 실험복과 마스크 착용, 화학 흄후드 내 작업, 배양액의 적절한 폐기물 처리와 같은 예방 조치를 반드시 준수해야 함을 잊지 마십시오.