작은 분자와 유도 Pluripotent 인간 배아 줄기 세포에서 인간의 연결을 Progenitors과 뉴런의 효율 유도

다음 실험의 전반적인 목표는 저분자 화합물 유도를 통해 다능성 인간 배아 줄기세포로부터 직접적이고 배타적으로 신경세포 자손을 유도하는 것입니다. 이는 정의된 조건 하에서 유지되는 미분화 세포에 레티노산(rettino acid)을 첨가함으로써 달성됩니다. 이후, 세포를 부유 배양으로 분리하여 신경모세포(neuroblast)라고 불리는 부유 세포 클러스터를 형성하게 함으로써 분화 과정을 지속합니다.

신경모세포를 신경 분화 배지가 담긴 조직 배양 플레이트에 부착시키면 성숙한 뉴런의 특성을 갖게 됩니다. 최종적으로, 면역형광법과 디컨볼루션 또는 공초점 현미경을 사용하여 레티노산 처리 후 처리된 인간 배아줄기세포의 형태 및 마커 발현에 미치는 영향을 확인할 수 있습니다. 다른 기술들의 경우 세포의 아주 작은 일부만이 뉴런 표현형을 갖게 되지만, 본 방법은 소분자의 간단한 제공만으로 다능성 인간 배아줄기세포를 뉴런 계통으로만 매우 효율적이고 정밀하게 유도할 수 있게 합니다.

스톡 솔루션을 조제할 때 주의해야 할 몇 가지 단계가 있습니다. Matrigel과 human laminin은 -80 °C에서 4 °C까지 하룻밤 동안 천천히 해동하도록 주의하십시오. 배지는 4 °C에서 보관하며, 사용 전에는 항상 배지를 37 °C로 가온하십시오. 또한, human ESL 배지를 준비할 때 일부 보충제는 사용 직전에 첨가합니다.

여기에는 BFGF, ascorbic acid, A에서 활성화된 human insulin 및 transferring이 포함됩니다. 다음으로, 플레이트 코팅 직전에 matra gel 또는 human laminin 작업 용액을 제조하십시오. gelatin이 사전 코팅된 조직 배양 플레이트가 준비되면, 플레이트를 37 °C, 5% CO2 조건에서 배양하십시오.

젤라틴은 matrigel 또는 laminin 작업 용액으로 대체할 수 있습니다. 이 플레이트들을 4 °C에서 하룻밤 동안 배양하여 코팅하십시오. 인간 ES 세포 콜로니를 5~7일 동안 성장시킨 후 분할 준비를 시작하십시오.

미분화된 인간 ES 세포가 75% 이상 포함된 콜로니를 선택하십시오. 이러한 콜로니는 대개 세포들이 겹겹이 쌓여 있으며, 경계가 뚜렷하고 약간 불투명한 형태를 띱니다. 분화가 시작되었다는 징후로 대개 흰색 콜로니가 나타나며, 대부분 분화된 세포를 포함하는 콜로니는 보통 투명하게 보입니다. 흰색 또는 투명한 콜로니는 선택하지 마십시오.

플레이트를 빛에 비추어 보고, 마커를 사용하여 플레이트 바닥에 있는 약간 불투명한 콜로니의 외곽선을 따라 표시합니다. 멸균된 P2 피펫 팁의 끝부분을 사용하여 인간 ES 세포 콜로니로부터 주변 섬유아세포 층을 분리합니다. 그런 다음 주변 섬유아세포와 콜로니의 분화된 모든 부분을 제거합니다.

이제 분리된 분화 세포가 포함된 기존 배지를 흡입하여 제거합니다. 다음으로 각 웰의 미분화 세포를 bFGF가 없는 인간 배아줄기세포(ES cell) 배지로 한 번 세척한 후, bFGF가 포함된 신선한 인간 배아줄기세포(ESL) 배지 3 mL를 첨가합니다. bFGF는 사용 직전에 신선한 배지에 첨가합니다. 이제 멸균된 P2 피펫 팁을 사용하여 콜로니를 작은 조각으로 자르고 플레이트에서 분리합니다.

분리된 콜로니 조각들을 배지와 함께 50 milliliter 원뿔형 튜브에 옮깁니다. 웰당 1 milliliter의 배지로 추가로 헹구어 냅니다.

이제 세포를 소분자를 사용하여 추가로 분화시킬 준비가 되었습니다. 먼저 갓 코팅된 플레이트를 37 °C로 가온합니다. 플레이트에서 코팅 용액을 흡입하여 제거하고, 콜로니 조각이 포함된 배지 4 mL를 각 웰에 분주한 다음, 플레이트를 흔들지 말고 조심스럽게 인큐베이터로 옮깁니다.

세포가 안착할 수 있도록 플레이트를 건드리지 마십시오. 3일간의 안착 기간 후, omic acid가 포함된 새로운 배지를 조제합니다. 그 다음, 세포가 잠겨 있을 정도의 양만 남기고 기존 배지의 대부분을 제거하십시오.

각 웰의 세포가 마르지 않도록 주의하십시오. bFGF와 레티노산(retinoic acid)이 포함된 신선한 인간 ES 세포 배지를 4 mL 첨가합니다. 배지를 격일로 교체하며 레티노산으로 처리된 인간 ES 세포 콜로니를 배양합니다.

7~8일 후, 세포는 형태학적 변화를 거쳐 커다란 분화 세포가 됩니다. 그런 다음 부유 세포 배양을 진행합니다. 부유 배양을 시작하려면 자발적으로 분화하여 이동해 섬유아세포 층을 형성한 세포로부터 ESL 콜로니를 분리하십시오. 앞서 언급한 기술과 멸균 피펫 팁을 사용하여, 부유하는 분리된 섬유아세포가 포함된 기존 배지를 흡입하여 제거하십시오.

HESC 배지로 세포를 한 번 세척하고 3 mL의 HESC 배지에 다시 현탁합니다. 이제 멸균된 P2 피펫 팁을 사용하여 콜로니를 작은 조각으로 자르고 플레이트에서 떼어냅니다.

분리된 콜로니가 포함된 배지를 단일 50 milliliter 원심분리관으로 옮깁니다. 웰을 1 milliliter의 배지로 헹구고, 이 헹굼액을 모아둡니다. 그런 다음, 모아진 세포 4 milliliter씩을 6-웰 초저부착 플레이트의 각 웰에 분주하고, 플레이트를 인큐베이터에 넣어 4~5일 동안 배양합니다.

이 시간 동안, 부유하는 세포 클러스터 또는 신경아세포(neuroblast)가 형성되어 신경아세포가 더욱 성숙한 뉴런 표현형으로 발달하게 됩니다. 이들이 포함된 배지를 50 milliliter 원심분리관(conical tube)으로 옮깁니다. 그 후, 세포를 1, 400 RPM에서 5분 동안 원심분리합니다.

기존 배지를 흡입하여 가능한 많은 양을 측정하고, VEGF NT3 및 BDNF가 함유된 새 NSC 배지를 동일한 양만큼 추가합니다. 피펫팅을 통해 세포를 현탁액으로 혼합한 후, 6-웰 조직 배양 플레이트의 각 웰에 현탁액 4 mL씩 분주합니다. 플레이트를 37 °C 습윤 인큐베이터로 옮깁니다.

신경모세포를 Matrigel 또는 인간 라미닌이 포함된 신경모세포 현탁액과 함께 배양 플레이트에 도말하여 하룻밤 동안 부착시켜 3D 배양을 수행합니다. 이후 37 °C에서 3D 매트릭스를 중합시킵니다. 배지는 이틀마다 교체합니다.

2주 이내에 뉴라이트(neurite)를 가진 신경 세포와 색소 세포의 광범위한 네트워크가 나타날 것이며, 레티노산(retinoic acid)은 정의된 배양 시스템에서 유지되는 인간 ES 세포가 다능성에서 신경 외배엽 표현형으로만 전환되도록 유도하기에 충분한 것으로 나타났습니다. 분화되지 않은 인간 ES 세포를 레티노산에 노출시키면, 콜로니 내의 모든 세포가 형태학적 변화를 일으켜 다능성 관련 마커인 OCT four의 발현이 중단된 거대 분화 세포로 변하였습니다. 또한, 이 세포들은 HNK one a, P two 및 TRKC와 같은 다양한 신경 외배엽 관련 마커를 발현하기 시작했습니다.

이러한 커다란 분화 세포들은 계속해서 증식하며 콜로니의 크기가 증가하였고, 초기 신경 세포 마커인 beta three tubulin을 자발적으로 발현했습니다. 더 성숙한 신경 세포 마커인 map two는 세포들이 층을 이루어 쌓인 콜로니 영역에서 나타나기 시작했습니다. 이와 동시에 신경 외배엽 세포가 나타나면서, 도파민성 신경 분화 및 tyrosine hydroxylase 유전자 활성화에 관여하는 신경 특이적 전사 인자인 NER one이 핵 내로 이동했습니다.

분리 후, basic FGF를 제거하고 레티노산(rettino acid)으로 처리한 인간 ES 세포를 현탁 배양하면 신경모세포(neuroblast)가 형성됩니다. 이 신경모세포를 조직 배양 플레이트에 부착시키면, 중추신경계(CNS)의 전형적인 특징인 신경突起(neurite)를 가진 신경세포와 색소 세포의 광범위한 네트워크가 효율적으로 급증하며 나타나기 시작하며, 3개월 이상 배양할 수 있습니다. 레티노산 처리 없이 세포가 자연적으로 다분화된 경우와 비교했을 때, 이러한 인간 ES 세포 유래 신경세포는 beta three tubulin을 발현했으며 map two를 공동 발현했습니다. 이 기술을 숙달하여 적절히 수행하면, 다능성 인간 배아줄기세포로부터 약 4주 만에 신경 전구세포와 신경세포를 균일하게 생성하는 데 사용할 수 있습니다.

인체 세포를 다루는 작업은 매우 위험할 수 있으므로, 이 절차를 수행하기 전에 항상 세포주에 병원체와 마이코플라스마가 없는지 확인하는 등의 예방 조치를 취해야 함을 잊지 마십시오.