식물의 성적 증명서의 정확한 현지화에 대한 원위치 하이브리드화에서

다음 실험의 전반적인 목표는 고감도 및 고특이성으로 세포 수준에서의 mRNA 발현 패턴을 시각화하는 것입니다. 이를 위해 우선 포르말린 고정 및 파라핀 포매된 조직 절편을 일련의 용액에 처리하여 왁스를 제거함으로써 조직을 투과시키고, 배경 신호를 유발할 수 있는 조직 내 양전하를 띤 아미노기를 차단합니다. 그 후, 표적 유전자에 특이적인 DIG 표지 RNA 프로브를 조직 절편에 침투시킨 뒤 슬라이드를 하룻밤 동안 하이브리드화합니다.

다음으로, 슬라이드를 RNA로 처리합니다. 섹션에서 비특이적으로 결합된 프로브를 제거한 후, anti-DIG 항체와 함께 배양합니다. 이를 통해 발색 화학 반응으로 하이브리드화된 프로브를 시각화할 수 있습니다.

결과는 광학 현미경으로 관찰했을 때, 조직 내에서 목적 유전자가 발현된 세포에서만 특이적으로 진한 파란색 신호가 검출됨을 보여줍니다. R-T-P-C-R, 마이크로어레이 또는 차세대 염기서열 분석(Next Generation Sequencing)과 같은 다른 발현 분석법과 비교하여 이 기술의 주된 장점은, 여기에서 제시된 In Situ Hybridization 프로토콜이 조직 맥락 내에서 목적 유전자의 발현 패턴을 드러내 준다는 점입니다. 이러한 방법들은 시각적 시연을 통해 학습하는 것이 가장 효과적인 많은 단계들을 포함하고 있습니다.

조직의 섹셔닝 및 임베딩 방법과 더불어, 독학으로 익히기 어려운 Al Hybridization pro 프로토콜의 핵심 단계들을 보여드리겠습니다. 파라알데히드로 고정된 조직의 임베딩 방법은 분석하려는 조직의 종류에 따라 달라집니다. 여기서 가장 중요한 점은 향후 섹셔닝을 위해 샘플의 방향을 정확하게 설정하는 것입니다.

포매의 한 가지 방법은 플라스틱 몰드와 링을 사용하는 것입니다. 이 절차를 시작하려면, 60 °C 가열판 위에서 몰드를 예열한 다음 용융 파라핀을 몰드에 붓습니다. 다음으로, 예열된 핀셋을 사용하여 조직 샘플을 각 몰드로 옮기고 원하는 위치로 방향을 잡습니다.

몰드를 플레이트에서 벤치로 조심스럽게 옮기고 몰드 위에 흰색 링을 배치하십시오. 몰드와 왁스를 추가로 넣습니다. 섹셔닝을 하기 전, 왁스가 서서히 식어 굳을 때까지 기다리십시오.

블록을 실온으로 가온한 후, 시료 주변에 약 1mm의 왁스가 남도록 각 블록을 사다리꼴 모양으로 다듬습니다. 두 평행한 면 중 더 긴 면이 바닥으로 가도록 다듬어진 블록을 마이크로톰 위에 놓습니다. 블록을 칼날 쪽으로 조심스럽게 이동시켜 블록의 표면이 칼날 단면과 평행한지 확인합니다.

8~10 µm 두께로 제작합니다. 알루미늄 호일과 같은 비점착성 표면 위에 왁스 리본을 정렬하고, 해부 현미경 하에서 관심 영역을 선택합니다. 그다음, 연필로 prob bon plus 슬라이드에 표시합니다.

INI two 하이브리다이제이션 프로토콜 중에 지워질 수 있으므로 마커 위에 펜을 사용하지 마십시오. 각 슬라이드에 깨끗한 milli Q water 1 mL를 분주합니다. 실온에서 관심 있는 절편을 수면에 조심스럽게 띄웁니다.

반짝이는 면이 물을 향하게 하십시오. 슬라이드를 슬라이드 워머 위로 천천히 옮깁니다. 온도를 35 to 37 °C로 설정하십시오.

일반적으로 사용되는 42°C와 달리 이 온도 범위에서는 절편 아래에 기포가 형성되는 것을 방지할 수 있습니다. 5분 후, 리본이 슬라이드 위로 내려올 수 있도록 한 번의 부드러운 동작으로 물을 조심스럽게 따라냅니다. 조직이 잘 부착되도록 슬라이드를 37°C에서 최소 수 시간 또는 하룻밤 동안 건조하여 조직 절편을 준비합니다.

in situ hybridization을 위해, 먼저 최종 탈파라핀화를 위한 탈파라핀 및 재수화 과정을 거칩니다. 슬라이드를 xylene 용액으로 10분씩 두 번 교체하며 침전시킵니다. 조직 절편을 재수화하기 위해, 농도가 점차 낮아지는 일련의 에탄올 용액에 슬라이드를 각각 30초 동안 통과시킵니다.

이 비디오에는 표시되지 않은 프로테아제 처리 과정 동안, 0.1 M 트리아민 용액이 담긴 유리 접시를 준비하여 흄 후드 내의 교반기에 설치하십시오. 금속 슬라이드 랙을 용액에 넣기 직전에, 트리아민, 완충액 및 교반액에 1.25 mL의 무수 아세트산을 첨가하십시오. 또한, 슬라이드 랙을 고정하기 위한 클램핑 시스템과 스탠드를 설치하십시오.

Starr 클램프의 속도를 줄여 슬라이드 랙을 스탠드에 고정하고, 교반 자석(stir bar)보다 높게 유지하며 랙을 용액 속에 내립니다. PBS로 헹구고 에탄올 시리즈를 통해 다시 탈수시킨 후 10분 동안 천천히 계속 교반합니다. 이제 조직 절편이 하이브리드화(hybridization)를 위한 준비가 되었습니다.

슬라이드를 깨끗한 표면에 놓고 5~10분 동안 공기 중에서 완전히 건조시킵니다. 변성된 프로브를 80 µL의 하이브리다이제이션 완충액에 첨가하여 프로브 하이브리다이제이션 완충액 혼합물을 준비합니다. 각 슬라이드에 대해 피펫팅으로 잘 섞어주되, 기포가 생기지 않도록 주의합니다.

프로브 하이브리다이제이션 버퍼를 피펫으로 분주합니다. 슬라이드의 오른쪽 가장자리에서 혼합합니다. 하이브리다이제이션 용액이 기포 없이 모든 섹션을 덮도록 확인하며 커버 슬립을 슬라이드 위에 서서히 내립니다.

기포가 형성된 부위의 커버 슬립을 손가락으로 가볍게 두드려 모든 조직 절편에서 기포를 제거합니다. 커버 슬립을 잡아당기면 절편이 손상될 수 있으므로 주의하십시오. 슬라이드를 UE water로 적신 watman paper가 들어 있고 param으로 대부분 덮인 습도 챔버에 넣습니다.

박스를 단단히 밀봉하고 슬라이드를 원하는 하이브리디제이션 온도(통상 50~55 °C)에서 16~20시간 동안 배양하십시오. 하이브리디제이션 프로토콜이 완료되면 슬라이드에서 커버슬립을 조심스럽게 제거합니다. 슬라이드를 세우면 커버슬립이 자연스럽게 떨어질 수 있으나, 그렇지 않은 경우 커버슬립을 강제로 잡아당기지 마십시오. 이는 절편을 손상시킬 수 있습니다.

대신에, 커버 슬립을 제거한 후 슬라이드를 따뜻한 0.2배 SSC에 1~2분간 담가 커버 슬립을 씻어내고, 슬라이드를 랙에 넣어 55 °C의 0.2배 SSC에서 여러 번 세척합니다. RNase 처리 후, 슬라이드를 랙에서 평평한 플라스틱 상자 바닥으로 옮기고 최소량의 블로킹 용액으로 덮습니다. 완만한 진동이 있는 플랫폼 위에서 실온으로 45분 동안 슬라이드를 블로킹합니다.

다음으로, 각 슬라이드 위에 항체 용액을 최소량만 직접 도포합니다. 슬라이드를 실온의 암소에서 2~3시간 동안 배양합니다. 배양이 완료되면 슬라이드를 깨끗한 평평한 상자로 옮기고, 실온의 쉐이킹 플랫폼 위에서 세척 버퍼의 최소량을 사용하여 슬라이드를 4회 세척합니다.

슬라이드를 TBS에서 한 번, TN 완충액에서 두 번 헹군 후, 갓 준비한 염색 용액을 슬라이드에 도포합니다. 먼저, 염색 용액을 작은 플라스틱 weighing dish에 붓습니다. 그런 다음, 절편 면이 서로 마주 보게 하여 두 슬라이드를 겹쳐 샌드위치 형태로 만듭니다.

샌드위치를 용액에 담가 모세관 현상으로 용액이 흡수되도록 합니다. 슬라이드를 킴와이프로 닦아냅니다. 슬라이드에 염색액을 채웁니다.

용액이 흘러 들어갈 때 기포가 생기지 않도록 슬라이드를 다시 가볍게 두드려야 할 수도 있습니다. 슬라이드를 플라스틱 상자에 넣고 실온의 어두운 곳에 보관하십시오. 서로 다른 프로브와 애기장대(arabidopsis) 조직을 사용하여 얻은 대표적인 결과가 여기에 제시되어 있습니다. 보라색 신호는 관심 유전자의 발현 패턴을 세포 해상도에서 직접적으로 시각화하여 보여줍니다.

패널 A는 영양 줄기 정단부에서 shoot Meli one 전사체의 국소화를 보여줍니다. 분열 조직의 부정정 성장 부위에서는 보라색-푸른색 신호가 나타나며, 주변 잎에서는 신호가 나타나지 않음에 유의하십시오. 패널 B-D는 Arabidopsis의 어뢰기 단계 배아 단면이며, B는 소수의 배아 줄기 세포에서 covata three의 발현을 보여줍니다.

C는 표피층에서 T ML one의 발현을 보여주며, D는 무작위 음성 대조군 RNA로 탐색한 절편에서 신호가 나타나지 않음을 보여줍니다. 다음 이미지들은 옥수수 조직에서 서로 다른 프로브를 사용하여 얻은 결과입니다. 패널 E는 발달 중인 옥수수 배아에서 STM Humalog knotted one의 국소화 위치를 보여줍니다.

배아 메리스템과 영양 shoot 정단부를 통과하는 뿌리 종단면에서 특히 강한 신호가 나타나며, 패널 F에서는 ARF3A가 축 하단 잎 표면에 발현되고, 패널 G에서는 ATML1 상동체인 OCL4가 표피에 특이적으로 발현됨을 알 수 있습니다. 예상대로 패널 H의 음성 대조군 프로브에서는 하이브리드화 신호가 관찰되지 않았습니다. 프로브의 시험관 내 전사 과정 중 각 단계별 기대 결과가 여기에 제시되어 있습니다. in situ 하이브리드화 프로브는 시험관 내 전사 후, DNAse 처리 및 후속 정제 과정을 거쳐 표준 ARAZ 젤에서 확인되었습니다. 프로브 1과 같이 길이가 250 base pair를 초과하는 프로브의 경우, 사용 전 탄산 가수분해를 거치면 다양한 크기의 더 작은 프로브 단편들이 생성됩니다.

이 그림은 100 ng/µL 농도의 대조군 프로브와 새로 DIG 표지된 3종의 프로브를 10⁻¹에서 10⁻⁵까지 희석하여 닷 블롯 분석(dot blot analysis)으로 수행한 색상 및 정량 검정 결과를 보여주며, 이들은 anti-DIG 항체 및 분석 시약과 함께 배양된 전이 막에 점적되었습니다. 분석 결과, 프로브 2의 추정 농도는 100 ng/µL, 프로브 3은 10 ng/µL, 프로브 4는 1 ng/µL로 나타났으며, 이는 프로브 4가 양호한 in situ hybridization 신호를 생성할 가능성이 낮음을 시사합니다. 마지막으로, Mace의 영양 생장 추 정단(vegetative shoot apex)을 가로지르는 이 종단면들은 비특이적 배경 신호와 정상적으로 작동하는 프로브 패널 간의 비교를 제공합니다.

A는 비특이적 배경 신호를 보여주는 반면, 패널 B는 외세포층에서 OC five 프로브에 대한 특이적인 in situ 이중 hybridization 신호를 보여줍니다. 이 영상을 시청한 후에는 in situ hybridization 프로토콜의 까다로운 단계들을 수행하는 방법을 충분히 익혀, 연구 대상 유전자의 정밀한 시공간적 발현 패턴을 결정할 수 있을 것입니다.