양적 Immunofluorescence를 사용하여 종양의 단백질 표현의 이질 매핑

다음 실험의 전반적인 목표는 인간 암 조직 전체 절편에서 바이오마커 발현을 정확하게 정량화하여 단백질 발현의 이질성 정도에 수치적 값을 부여하는 것입니다. 이는 먼저 전체 슬라이드 형광 스캐너를 사용하여 면역 형광 염색된 암 조직 절편을 스캔함으로써 수행됩니다. 그다음, 종양 내에서 평가할 관심 영역(regions of interest)을 선택합니다.

그 후, aqua 분석 자동 이미지 분석 시스템을 사용하여 침습적 종양 부위 내의 표적 단백질 발현량을 정량화합니다. 궁극적으로, 이 방법은 조직 절편 전반에 걸쳐 매우 불균질한 경우가 많은 암 조직 내의 바이오마커 발현 지도를 작성하는 데 사용될 수 있습니다. 색상 및 계량 시각화 시약을 이용한 면역조직화학 염색과 같은 전통적인 방법보다 이러한 기술을 사용했을 때의 주요 장점은 면역형광법이 더 정량적이고 더 민감하다는 점입니다.

이러한 분석 방법들을 전체 절편 면역형광 스캐닝과 결합하면, 조직 전반에 걸친 바이오마커 발현의 미세한 변화를 정밀하게 매핑할 수 있습니다. Histo RX 실험실의 운영 총괄 책임자인 Mark Gustafson이 이러한 절차를 처음으로 시연합니다. 암 조직 생검 표본을 마이크로톰으로 절편화하고 관심 바이오마커의 발현을 확인하기 위해 면역형광 염색을 수행한 후, 염색된 절편이 담긴 슬라이드를 최대 5장까지 슬라이드 스캐너의 슬라이드 카세트에 적재하십시오.

그런 다음 scan scope 콘솔의 인터페이스를 사용합니다. 각 슬라이드에 대해, 염색 패턴이나 샘플의 다른 관찰 가능한 양상에 관계없이 슬라이드 상의 모든 조직을 포함하는 영역을 선택하십시오. 다음으로, scan scope 콘솔을 사용하여 조직의 평가 영역을 선택하는데, 이때 최선의 대표성을 제공할 수 있도록 가급적 조직의 종양 영역 내에서 선택하십시오.

이제 스캔 스코프 콘솔의 자동 노출 기능을 사용하여 각 채널의 노출 시간과 이미지 초점을 결정하십시오. 스캔 스코프 콘솔 이미지의 파란색 다이아몬드를 사용하여 조직에서 떨어져 있으면서도 커버 슬립 아래의 슬라이드 영역 내에 있는 추가 영역을 선택하여 평면 보정(flat field correction) 이미지를 획득할 배경 영역을 정의하십시오. 각 필터에 대해 노란색 사각형으로 표시된 조직 영역에 초점 포인트를 추가하여 이미지 캡처를 최적화하십시오. 이미지에 배경 신호가 높거나 다른 이미지 아티팩트가 나타나는 경우, 이미지 영역을 이동하여 새로운 이미지를 획득해야 합니다.

그 후 조직을 스캔하며, 획득한 디지털 슬라이드 이미지는 Aperio spectrum 데이터베이스로 자동 업로드됩니다. spectrum 프로그램의 썸네일 이미지를 더블 클릭하여 spectrum 데이터베이스의 디지털 슬라이드 목록에서 분석할 슬라이드를 선택하십시오. 그런 다음 함께 제공된 h 및 D 주석 이미지를 사용하여 형광 이미지 상의 관심 영역(region of interest)에 주석을 추가하십시오.

단일 샘플에서 개별 원으로 구분된 여러 관심 영역을 선택할 수 있습니다. 주석이 달린 이미지는 스펙트럼 데이터베이스에 자동으로 저장됩니다. 이제 화면 상단의 메뉴 바에서 Analyze를 선택하고, 분석 창이 나타나면 드롭다운 메뉴에서 histo RX aqua analysis를 선택하십시오.

시작할 준비가 되면 분석(analyze) 버튼을 누르십시오. Windows 작업 표시줄에 최소화된 콘솔 창이 나타나 Spectrum 데이터베이스에서 로컬 컴퓨터로 이미지가 전송되는 진행 상황을 표시합니다. 데이터 전송이 완료되면 aqua 분석이 시작되어, 샘플의 1차 임계값(배경 이미지 신호보다 높은 pan cytokeratin 이미지 신호)의 데이터 클러스터링을 기반으로 하는 비지도 aqua 스코어링 알고리즘을 통해 aqua score를 생성합니다. 이를 통해 픽셀을 사용하여 종양 마스크를 정의할 수 있으며, 정의된 마스크는 이후의 계산에 사용될 수 있습니다.

고발현 pan cytokeratin 픽셀을 사용하여 종양 세포의 세포질 또는 비핵 영역을 함께 정의하십시오. 여기에서 보는 바와 같이, 종양 마스크 내에 있으며 DPI 채널에서 높은 신호를 보이는 픽셀은 핵 성분으로 식별됩니다. 검토 과정에서 시료 또는 이미징 아티팩트로 인해 점수 산정에 적합하지 않은 영역이 발견되면, 해당 영역은 점수 산정에서 제외되며 최종 결과는 '실패(fail)'로 처리됩니다.

aqua scoring 결과는 전체 조직 절편 샘플 내 관심 영역에 있는 각 512 by 512 픽셀 타일과 연관된 점수 표로 나타나며, 이는 저장되어 후속 통계 분석에 사용될 수 있습니다. 이 hematoxylin 및 eosin 염색 광학 현미경 사진은 동일한 난소암의 서로 다른 영역이 어떻게 다양한 형태를 보일 수 있는지를 보여줍니다. Figure B의 우측 상단 고배율 뷰는 종양 상단부에서 세포질 투명화와 고형 성장 패턴을 보이는 세포들을 강조하여 보여줍니다.

그러나 그림 C의 오른쪽 하단 섹션에서 확대된 조직의 아랫부분은 더 균질한 호산성 세포질과 유두상 성장 패턴을 보입니다. 여기에서는 화학요법 치료 전과 후의 난소암 조직 절편 내 ER 발현의 이질성 히트맵이 각각 상단과 하단 패널에 표시되어 있습니다. 상단 그림에서는 절편 전체에 걸쳐 고발현 및 저발현 영역이 혼재되어 ER 발현이 가변적이었으나, 하단 그림에서는 빨간색으로 표시된 높은 ER 발현이 균일하게 분포하는 것으로 변화했음에 유의하십시오.

이러한 변화의 수치적 표현은 왼쪽의 Simpsons 지수 감소로 나타나 있습니다. 이 그림에서는 난소암 조직 절편 내 HER two의 이질성 히트맵을 치료 전과 후로 나누어 각각 상단과 하단 패널에 다시 보여줍니다. 상단 그림에서는 절편 전체에 걸쳐 고발현 및 저발현 영역이 모두 존재하는 가변적인 HER two 발현 양상을 보이다가, 하단 그림에서는 HER two 고발현이 균일하게 분포하는 상태로 변화한 점에 다시 주목하십시오.

심슨 지수(Simpsons index)가 다시 한번 감소하는 것을 확인할 수 있습니다. 이 절차를 수행할 때, 컴퓨터 분석을 통해 생성된 데이터의 품질은 염색의 품질에 좌우되므로, 염색 작업이 높은 기술적 표준으로 이루어져야 한다는 점을 기억하는 것이 중요합니다.