의 양적 비교 CIS - 규제 요소 (CRE) 활동 Drosophila melanogaster

이 절차의 전체적인 목표는 drosophila melanogaster의 변태 발달 과정 중 활성화되는 CIS 조절 요소 또는 CRE의 유전자 조절 활성을 정량적으로 측정하는 것입니다. 먼저 부위 특이적 통합법을 사용하여 리포터 트랜스진으로 CRE가 형질전환 통합된 라인을 생성합니다. 실체 현미경을 사용하여 적절한 발달 단계의 형질전환 표본을 확보하십시오.

외부 튜브에서 표본을 꺼내 유리 현미경 슬라이드에 고정합니다. 공초점 현미경 분석을 통해 전체 마운트 샘플에서 형광 리포터 단백질 발현의 수준과 패턴을 기록합니다. 마지막으로, Image J 소프트웨어 도구를 사용하여 기록된 공초점 이미지의 형광 리포터 단백질 발현 수준을 정량화합니다.

이러한 결과는 유전자 조절 활성 수준을 할당하여 조절 요소를 보조하고, 수정된 CRE 버전에 대한 추가적인 비교 유전자 발현 연구를 용이하게 합니다. 이 절차는 유전자 조절 및 해당 유전자 조절의 인코딩 방식에 관심이 있는 분들에게 핵심적인 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. DNA는 발생 및 진화 생물학의 기초가 됩니다.

본 절차는 초파리(drosophila melanogaster)의 변태 발달 과정 중 작동하는 cis 조절 요소에 대한 통찰을 제공하기 위해 개발되었습니다. 원칙적으로, 이 방법은 다른 발달 단계나 다른 초파리 종, 또는 다른 모델 생물에서 작동하는 cis 조절 요소에도 적용할 수 있습니다. 형질전환 계통을 확장하려면, 격일로 수컷과 암컷 초파리를 여러 마리씩 넣어 두 개의 바이알을 준비하십시오.

파리를 기존 바이알 중 하나에서 새 바이알로 옮깁니다. 이 과정을 일주일 동안 반복합니다. 2주가 지났을 때, 형질전환 초파리가 유충부터 성체까지의 발달 단계에 걸쳐 있는지 확인합니다.

ER이 형성되는 3령 유충 단계의 끝에서 표본의 단계별 관찰을 시작하십시오. 표본이 움직이지 않는 상태임을 확인하십시오. ER이 부드러운 흰색을 띠고 구형 구조가 외반된 시점을 이 단계로 지정하십시오.

0 HAPF 단계에서, 체중앙 부근에 양측으로 위치한 생식샘의 존재 여부로 수컷과 암컷을 구분합니다. 생식샘은 투명한 원형으로 보이며, 이를 통해 변태 길이에 따른 단계 설정을 수행합니다. 0 HAPF에, 젖은 붓을 사용하여 표본을 새 바이알로 옮깁니다.

Kimwipe 조각을 넣고 물로 적셔 표본이 건조되는 것을 방지합니다. 이제 원하는 HAPF가 될 때까지 바이알을 25 °C에서 배양합니다. 또는 동반 텍스트에 상세히 설명된 대로 여러 형태학적 마커의 존재 및 위치 식별을 기반으로 분류하여 표본의 단계를 설정합니다.

실험용 테이프를 사용하여, 접착면이 위를 향하도록 포장용 테이프 조각을 해부판에 부착합니다. 붓에 물을 묻혀 고정된 표본에 수분을 공급합니다. 표본을 Kim wipe로 옮깁니다.

표본을 패킹 테이프로 옮기고 등 쪽이 위를 향하도록 부착합니다. 표본을 15분 동안 건조합니다. 핀셋을 사용하여 ER을 점진적으로 엽니다.

전단 또는 영구 고정 부위부터 시작하여 후단 방향으로 진행하십시오. 그 다음 pui를 현미경 슬라이드 위의 점성 오일 한 방울로 옮기고, 전체 마운트 표본의 경우 현미경으로 표본을 평가하십시오. 표본의 초점을 맞추기 위해 4x 또는 10x 대물렌즈를 사용하십시오.

공초점 현미경 소프트웨어를 사용하여 광퇴색을 방지하기 위해 원하는 형광 단백질에 맞는 여기 파장을 조절합니다. 레이저 강도를 5~10%로 설정하여 시작하십시오. 신호가 충분하지 않은 경우, 신호 대 잡음비를 개선하기 위해 필요에 따라 강도를 높입니다. 공초점 이미지의 경우, CRE 활성의 정량적 비교를 위해 칼만 평균화(kalman averaging)와 같이 반복 스캔의 픽셀 측정값을 평균화하는 소프트웨어 설정을 활성화하고, 형광이 가장 강하게 나타나는 C-section을 사용하십시오.

포화 경고 룩업 테이블(saturation warning lookup table)로 전환하고, 포화되는 픽셀이 거의 없도록 채널 전압 이득(voltage gain)과 오프셋(offset)을 조정하십시오. 필요한 경우 공초점 조리개(confocal aperture)를 조정하십시오. 최적의 설정이 결정되면 ZS 스캔을 실행하여 Z축을 따라 일련의 이미지를 획득하십시오.

스캔이 완료되면, 이미지 스택을 투영 이미지로 변환하고 이 이미지 파일을 TIF 형식으로 저장하십시오. CRE 활성의 정량적 비교를 위해, 모든 반복 시료 및 리포터 트랜스젠 라인에 대해 동일한 공초점 설정값을 사용하십시오. Image J 프로그램을 실행하여 실험을 시작한 후, 분석할 TIFF 이미지를 여십시오.

자유 선택 버튼을 클릭하고 정량이 필요한 시편 영역의 외곽선을 그립니다. 픽셀 값 통계를 얻으려면 분석 탭을 클릭한 다음 측정을 선택하십시오. 결과 상자에서 평균 픽셀 값 점수를 기록합니다.

CRE가 활성화되지 않은 배경 영역에서 두 번째 평균 픽셀 값을 수집하십시오. 보정된 평균 픽셀 값을 도출하기 위해, 반복 실험 표본에 대해 픽셀 값 통계를 계속 생성하십시오. 그런 다음, 복제본의 보정된 평균 픽셀 값들로부터 A CRE의 평균 조절 활성을 결정하고 평균의 표준 오차를 계산하십시오.

본 실험에서는 white rescue eye 표현형의 강도를 이용하여 형질전환 라인을 동형접합체로 만듭니다. 부위 특이적 외래유전자 삽입을 위해 A TTP landing site 서열을 가진 white 유전자 돌연변이 유전 배경이 활용됩니다. 삽입된 mini white 유전자의 복제 수에 따른 복구된 눈 색깔 표현형의 강도를 통해, 삽입된 벡터에 대해 반접합체인 개체와 동형접합체인 개체를 구별합니다.

그 후 가장 어두운 눈 색깔 표현형을 가진 수컷 및 암컷 초파리를 교배시켜 동형접합체 계통을 확립합니다. 형태학적 마커는 유충에서 성체 초파리로 변태하는 과정 중 초파리의 변태 단계를 결정하는 데 사용됩니다. 표본은 일련의 정형화된 형태학적 변화를 거치며, 이를 통해 성별을 결정하고 발달 단계를 추정할 수 있습니다. 여기에서.

이형 요소(dimorphic element)라고 불리는 CRE의 야생형 버전은 암컷 puy의 ASIC 복부 분절에서 높은 수준의 EGFP 리포터 발현을 유도합니다. 이 CRE 내의 13 base pair 서열이 DSX 전사 인자의 결합 부위임이 밝혀졌으며, 이 서열의 in vivo 중요성은 해당 결합 부위를 돌연변이시켰을 때 CRE의 조절 활성을 정량화함으로써 입증됩니다. 정량 분석 결과, 본 연구에서 사용된 트랜스진 삽입 부위 환경에서 이 DSX 부위의 돌연변이는 조절 활성을 야생형 발현의 28 ± 3%로 감소시키는 것으로 나타났습니다.

유사한 비교 분석을 통해 종 내 CRE 대립유전자 또는 서로 다른 종의 자가 CRE 간의 조절 활성을 평가할 수 있으며, 예를 들어 암컷 분절에서의 EGFP 수준과 비교할 수 있습니다. D Melin gastric Canin S strain에 의해 구동된 실험에서 D stimulants 및 D willi 종의 자가 CRE는 각각 75 ± 4%와 0 ± 0%에 해당하는 조절 활성을 나타냅니다. 이러한 전사 인자 유전자가 CIS 조절 요소와 어떻게 상호작용하는지에 대한 추가적인 의문을 해결하기 위해 RNA 간섭과 같은 후속 절차 방법들을 전사 인자 유전자에 적용할 수 있습니다.

이는 CIS 조절 요소에 의해 구동되는 형광 리포터 단백질 발현의 증가 및 감소를 통해 나타날 것입니다. 이 절차는 유전자 조절 분야의 연구자들이 cis 조절 요소 모티프와 진화된 돌연변이가 유전자 발현에 미치는 기능적 중요성을 탐구할 수 있는 길을 열어주었습니다.