안달 Ratiometric하여 세포주기를 통해 키나제와 인산 가수 분해 효소 활동을 모니터링

본 영상에서는 Förster Resonance Energy Transfer(FRET)를 이용하여 세포 주기 전반에 걸쳐 키나아제(kinase)와 포스파타아제(phosphatase)의 활성을 관찰합니다. 여기서는 한쪽 끝에 시안 형광 단백질(CFP)이, 다른 쪽 끝에 황색 형광 단백질(YFP)이 배치된 Polo-like kinase 1(PLK1) 활성 프로브를 사용합니다. 이 프로브를 U2 OS 세포에 형질전환합니다.

그런 다음 G2/M 전이 과정 중 LK1 표적의 인산화 상태를 조사하기 위해, 형질전환된 U2 OS 세포를 대상으로 타임랩스 형광 이미징을 수행합니다. CFP와 YFP가 서로 가까이 위치하고 CFP가 흥분되면, 에너지가 YFP로 전달되어 YFP 방출을 검출할 수 있습니다. 하지만 프로브가 인산화되면, 단백질의 구조적 변화로 인해 CFP와 YFP가 서로 분리됩니다.

이제 CFP가 여기되면, 강한 CFP 방출과 약한 YFP 방출만이 검출됩니다. CFP와 YFP 모두를 여기시킨 후 YFP 방출 비율을 정량화하면 PLK1 활성이 G2기에 증가하여 유사분열 중에 정점에 도달한다는 것을 알 수 있습니다. 따라서 표준 형광 촬영과 같은 기존 방법보다 이 기술이 갖는 주요 장점은, 촬영 조건이나 프로브의 발현으로 인해 세포 주기가 교란되지 않도록 특별히 주의를 기울였다는 점입니다. 이 방법은 특정 인산화효소나 탈인산화효소가 언제 어디서 활성화되는지와 같은 세포 주기 분야의 핵심적인 질문들에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다.

이 방법은 세포 주기 조절 효소에 대한 통찰을 제공할 수 있을 뿐만 아니라, 세포 증식 분석과 같이 비정지 상태(unres conditions)가 요구되는 다른 시스템에도 적용 가능합니다. 인간 세포 주기를 모니터링하기 위해, U2 OS 세포에 FRET 기반의 PK1 활성 프로브를 형질전환합니다. 표준 인산칼슘 형질전환법을 사용하여, 세포를 최소 7일 동안 puromycin으로 선별합니다.

이는 프로브를 발현하는 세포군을 농축하고, 세포 주기에 심각한 영향을 미치거나 독성 수준으로 발현되는 세포의 수를 제한합니다. 이후 제한 희석법을 통해 CFP 발현이 확인되는 안정적인 클론을 선별한 다음, YFP 발현을 검토하여 모든 세포에서 대략 동일한 비율로 존재함을 확인합니다. 일부 세포가 CFP 또는 YFP만 포함하고 있다면 상동 재조합이 일어났을 가능성이 높으므로, 이 경우 sure 2 세포와 같이 상동 재조합이 덜 일어나는 박테리아를 사용하여 플라스미드 준비 과정을 반복한 후, 플라스미드를 선형화하여 형질전환을 다시 수행하십시오.

세포가 프로브를 안정적으로 발현하면, 세포가 부착되어 30~50% 정도 합류(confluent)되었을 때 1.5번 유리 바닥 접시(glass bottom dish)에 분주합니다. 배지를 CO2 독립적이며 페놀 레드(phenol red)가 포함되지 않은 것으로 교체하고, 온도가 37 °C로 설정된 전동 에피 형광 현미경에 세포를 장착합니다. 현미경에는 CFP 및 YFP 여기 및 방출 필터가 갖춰져 있어야 합니다.

CFP 및 YFP 모니터링에 적합한 ROIC 미러와 요구되는 해상도에 적합한 대물렌즈를 준비합니다. 여기서는 20 x NA 0.75 공기 대물렌즈가 사용되었습니다. 투과광을 이용하여 세포의 초점을 맞춥니다.

이 시점에서는 형광등을 사용하지 마십시오. 형광등은 세포 주기를 교란할 수 있는 스트레스 반응을 유도하기 때문입니다. 광독성을 방지하려면, 필요한 세포 내 해상도를 확보할 수 있는 범위 내에서 굴절률을 최대값으로 설정하십시오. 본 실험에서는 핵과 세포질을 구분할 수 있어야 합니다.

짧은 노출 시간을 설정하고 고밀도 중성밀도 필터를 삽입하십시오. 그런 다음 YFP 여기 및 방출을 사용하여 12비트 또는 16비트 테스트 이미지를 획득하십시오. 세포 내 평균 강도가 배경 강도에 배경 강도의 최소값과 최대값 차이의 5배를 더한 값과 거의 같아지도록 노출 시간과 중성밀도 필터를 조정하십시오. 이미지가 포화되지 않았는지 확인하려면 샘플 이미지의 형광 강도를 검토하십시오.

세포가 분열기로 진입할 때 발생하는 강도 차이를 고려하여, 이미지의 최대 강도는 다이내믹 레인지의 절반 미만이 되어야 합니다. 다음으로, CFP 여기 필터와 YFP 방출 필터를 사용하여 이 과정을 반복하십시오. 초점 맞춤 및 노출 조건 최적화에 사용된 영역을 제외하고, 형질전환된 세포가 포함된 여러 영역을 선택하십시오.

이러한 절차들이 스트레스 반응을 유발했을 수 있으므로, 모든 세포에서 최대 강도가 동적 범위의 절반 미만이 되도록 확인하십시오. 소프트웨어를 사용하여 YFP 여기, YFP 방출 및 CFP 여기, YFP 방출 필터를 이용해 45분마다 두 개의 이미지를 획득하도록 설정하십시오.

또한 실험의 총 길이를 세포 주기 기간보다 길게 설정하십시오. 모든 설정이 완료되면 이미지 획득을 시작하십시오. 획득이 완료된 후, 획득한 이미지를 열어 유사분열에서 다음 유사분열까지의 세포 주기 시간을 모니터링하십시오. 여기서 형질전환된 프로브를 발현하는 세포의 경우, 세포 주기 시간은 대략 20에서 25시간이었습니다.

이를 사용된 세포 유형의 대조군 데이터와 비교하십시오. 세포 주기 시간이 참조 타이밍과 일치하면 FRET 분석이 가능합니다. 타이밍이 확인되면 이미지를 분석할 수 있습니다.

분석은 대부분의 현미경 전용 소프트웨어로 수행할 수 있습니다. 여기서는 ratio plus 플러그인이 설치된 Image J 프리웨어를 사용합니다. Image J에서 이미지를 열어 분석을 시작하십시오. 이미지가 다색 스택 형식인 경우, Image 메뉴에서 하이퍼 스택으로 변환하여 개별 채널을 분리하십시오.

그 다음 hyper stack을 선택한 후 stack to hyper stack을 클릭합니다. 설정값이 표시된 convert to hyper stack 창이 열리면 확인(okay)을 클릭합니다. 이제 이미지 아래에 두 개의 슬라이더 바가 표시됩니다.

이미지를 단일 채널 스택으로 분리하려면, 이미지 위에서 클릭한 후 hyper stack reduce dimensionality를 선택하십시오. 그러면 reduce 창이 열리는데, 여기서 frames와 keep source가 선택되었는지 확인하십시오. 그런 다음 Okay를 클릭하십시오.

단일 채널만 포함된 새 이미지가 나타납니다. 이 과정을 반복하여 두 번째 채널이 포함된 새 이미지를 띄웁니다. 다음으로, 최종 이미지의 시각적 선명도를 높이기 위해 YFP excitation YFP emission 스택을 선택합니다.

프로세스(process)를 클릭한 다음, 수학(math)을 클릭하십시오. 이후 곱하기(multiply)를 클릭하십시오. 곱하기 창이 열리면, YFP excitation YFP emission 스택에 3을 곱하기 위해 3을 입력하십시오. 이 단계는 선택 사항이며, 비율이 0과 1 사이의 범위에 있지 않도록 하기 위해 수행합니다.

다음으로, Image J 툴바에서 freehand 툴을 선택합니다. 그런 다음 YFP excitation, YFP emission 스택에서 세포가 없지만 측정할 세포와 가까운 영역에 관심 영역(ROI)을 지정한 후, analyze tools를 클릭하여 ROI manager에 ROI를 추가합니다. 이어서 ROI manager를 클릭합니다.

ROI 관리자 창이 나타납니다. 추가를 클릭하여 YFP excitation YFP emission 스택에서 ROI의 평균 강도를 측정하기 위한 ROI 좌표를 저장하십시오. 분석을 클릭한 다음 측정을 선택하십시오.

결과 창이 열립니다. CFP 여기 YFP 방출 스택을 선택하십시오. 그다음 ROI 관리자에서 해당 ROI를 더블 클릭하고 측정을 반복하십시오.

측정값이 결과 창에 추가됩니다. 스택의 다른 위치로 스크롤하여 여러 시점에서 이 과정을 반복하십시오. 결과 창의 측정값을 비교하여 관심 세포 주변의 배경 강도가 필름 전체에서 유사한지 확인하십시오.

최소 강도를 포함하여 측정값을 설정하려면 분석(analyze)을 클릭한 다음, 측정값 설정(set measurements)을 클릭하고 최소 및 최대 그레이 값(gray value)을 지정하십시오. 이어서 측정 대안을 보여주는 창이 나타납니다. 필요에 따라 밝기와 대비를 조정한 후, 세포의 대부분을 덮는 ROI를 그려 두 스택(stack) 모두에서 최소 강도를 측정하십시오.

그런 다음, 이번에는 배경 대신 세포를 사용하여 이전과 동일하게 측정합니다. 결과 섹션의 값들을 사용하여 측정된 최소 강도와 배경 강도의 차이를 계산하고 이를 2로 나눕니다. 이를 통해 clipping value to open ratio 및 select plugins를 위한 초기 추정값을 얻을 수 있습니다.

그 다음 ratio plus를 선택합니다. FRET 비율의 경우, CFP 들뜸 YFP 방출 S stack 1을 선택하거나, 인산화 시 FRET 효율이 감소하는 프로브를 시각화하기 위한 inverted FRET 비율의 경우 YFP 들뜸 YFP 방출 S stack 1을 선택하여 측정된 배경 강도와 클리핑 값을 입력합니다.

결과 창의 값들을 사용하여 ratio plus 창에 붙여넣으십시오. 결과로 생성된 ratio stack의 스케일을 설정하고, ratio 변화를 시각화하기 위해 적절한 lookup table을 적용하십시오. PLK1 활성을 모니터링하는 FRET 기반 프로브를 발현하는 U2 OS 세포를 본 동영상에 설명된 대로 60시간 동안 촬영하였습니다.

이 이미지는 딸세포의 분열을 포함하여, fret 프로브를 발현하는 50개 세포의 누적 유사분열 진입을 보여줍니다. 프로브를 발현하는 대부분의 세포는 20에서 25시간 사이의 세포 주기 시간으로 증식하며, 이는 이미징 조건과 프로브의 발현 수준이 세포 주기 타이밍에 영향을 미치지 않음을 나타냅니다. 한 세포의 4회 분열 과정을 추적한 반전 fret 비율의 가색(false color) 표현은 상당한 노이즈가 있음에도 불구하고, PK one 활성이 G two에서 증가하여 유사분열 중에 정점에 도달하는 경향이 있음을 보여줍니다.

원시 데이터를 평균 필터링하여 그래프로 나타내면 활성 정점 사이의 시간을 쉽게 추정할 수 있습니다. 이 그림은 이전 이미지에 표시된 세포의 역 FRET 비율 정량화 결과를 그래프로 보여줍니다. 활성화 시점을 추정할 수 있으며, 여기서 알 수 있듯이 프로브의 인산화는 유사분열에서 인산화가 정점에 도달하기 약 4시간 전에 관찰되기 시작합니다.

이 절차를 수행할 때는 세포가 스트레스를 받지 않는 상태를 유지하는 것이 중요하므로, 빛에 대한 노출을 최소화하고 온도나 pH의 변화를 최소화해야 합니다. 또한, 이 방법은 세포 내 키나아제(kinase)와 포스파타아제(phosphatase) 활성 사이의 균형을 모니터링한다는 점을 기억하는 것이 중요합니다. 이 절차는 RNA 간섭이나 억제제 스크리닝과 결합하여 이러한 키나아제 및 포스파타아제의 상위 조절 인자를 식별하는 데 활용될 수 있습니다.