모니터링 죽습 Caspase - 3 활동 및 칼륨 - 유도 막 탈분극 다음 라이브 세포 이미징 및 Cleaveable 형광 염색 기판을 사용하여 불후의 Oligodendroglial 세포의 Apoptosis

본 절차를 통해 oligo DDR 글리아 세포 사멸을 실시간으로 모니터링할 수 있습니다. 우선 세포를 배양한 다음, 살아있는 세포 이미징을 위한 준비 과정을 거칩니다. 그다음 단계로 세포에 처리를 수행하고 형광 현미경을 사용하여 그 효과를 모니터링합니다.

마지막 단계는 데이터 분석을 수행하는 것입니다. 최종적으로, caspase 활성화 형광 염료의 핵 형광을 모니터링함으로써 처리 또는 자극 후 세포 집단의 세포 사멸률을 확인할 수 있습니다. 면역 염색과 같은 기존 방법과 비교했을 때 이 기술의 주요 장점은 여러 시점의 데이터를 동시에 수집할 수 있다는 점입니다.

이 방법은 약물, 시약 및 다양한 처리에 대한 반응과 같은 세포 생물학의 핵심 질문들에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이제 이 방법을 통해 세포 배양 내의 사멸에 대한 통찰력을 얻을 수 있습니다. 또한 뇌 절편을 포함한 ex vivo, 기관형 조직(organotypic tissues)과 같은 다른 시스템에도 적용 가능합니다.

일반적으로 이 방법에 익숙하지 않은 연구자들은 고정 조직이 아닌 살아있는 조직을 다루는 방식에 적응하는 데 어려움을 겪을 수 있습니다. 고정 조직에 비해 살아있는 세포 샘플을 준비하는 단계가 훨씬 많기 때문에, 이 기술의 시각적 시연이 중요합니다. 먼저, 동결된 immortalized N 19 oligo droog glial cells를 37 °C 항온수조에서 해동합니다.

10% FBS와 1% penicillin streptomycin이 첨가된 high glucose DMEM 7 mL를 10 cm 배양 접시에 넣습니다. 그런 다음 세포 현탁액을 접시에 한 방울씩 떨어뜨리고, 페트리 접시를 가볍게 흔들어 세포를 고르게 분산시킵니다. 세포를 5% 이산화탄소 배양기 내 34 °C에서 4시간 동안 배양합니다.

남아있는 DMSO 및 동결보호제를 제거하기 위해 플레이트에서 배지를 흡입하여 제거합니다. 4~7일간 배양한 후 7mL의 신선한 배지로 교체합니다. 세포가 70~80%의 합쳐짐(confluence)에 도달하면 배지를 흡입하여 제거하고, 세포 시트 위에 1mL의-drips-를 피펫으로 떨어뜨린 후 실온에서 5분 동안 배양합니다.

그 다음 세포를 회수하여 10 centimeter 조직 배양 접시에 0.1 × 10⁶ cells/mL의 밀도로 파종하고, 이 접시를 조직 배양 인큐베이터에 넣습니다. 한 번 더 배양한 후, 세포를 라이브 셀 이미징 실험을 위해 플레이팅할 수 있습니다. 이를 위해 이전과 동일하게 세포를 회수한 다음, 세포 현탁액 30 µL를 취하여 혈구계수기(hemocytometer)를 이용해 세포 수를 측정합니다.

다음으로, 멸균 핀셋을 사용하여 코팅되지 않은 유리 커버슬립을 배치합니다. 6-웰 플레이트의 각 웰에 0.1 × 10⁶ cells/mL 밀도로 세포를 분주합니다. 10% FBS와 1% penicillin streptomycin이 첨가된 phenol-free DMEM high glucose 배지 2mL 내에서, transfection 전까지 34 °C, 5% CO₂ 조건으로 세포를 하룻밤 동안 배양합니다.

다음 날, 100 µL의 무혈청 배지와 0.5~4 µg의 정제된 플라스미드 DNA, 그리고 4 µL의 FUgene HD를 혼합합니다. 혼합물을 가볍게 두 번 볼텍싱한 후, 상온에서 5분 동안 DNA 복합체가 형성되도록 둡니다. 배양 시간이 지나면, FUgene HD-DNA 혼합물을 배양 중인 세포에 직접 첨가합니다.

플레이트를 부드럽게 기울여 혼합합니다. 그 다음, 처리 또는 실험 전 34 °C, 5% CO2 조건에서 세포를 48시간 동안 추가로 배양합니다. 먼저 LCI Cham light live cell instrument 제어 박스의 전원을 켭니다.

스테이지를 충분히 가열하기 위해 실험 시작 3시간 전에 이 작업을 수행해야 합니다. 최소한 실험 시작 1시간 전에는 컨트롤 박스의 전원을 켜야 합니다. 다음으로, 클린벤치 내에서 LCI Cham light magnetic type 배양 챔버와 포셉에 70% ethanol을 분사하고 5분 동안 건조시킵니다.

인큐베이터에서 세포를 꺼내 현미경으로 관찰하여 세포의 상태가 건강한지 확인하십시오. 세포는 유리 커버슬립 위에 잘 퍼져 있어야 하며, 수많은 막 돌기(membrane process)가 있는 건강한 모습이어야 합니다. 돌기 연장 수가 적거나 핵의 모양이 불규칙한 세포는 트랜스펙션으로 인해 스트레스를 받았을 가능성이 높으며, 클린벤치(flow hood)에서 진행하는 후속 실험에 부적합합니다.

6-웰 플레이트를 기울이고 핀셋으로 커버슬립을 제거합니다. 커버슬립의 세포가 있는 면이 위로 향하게 하여 챔버의 하단 플레이트에 빠르게 놓습니다. 이때 커버슬립이 마르지 않도록 주의하십시오.

다음으로, 배양 챔버의 자성 본체를 부착하고 기존 6-well 플레이트의 배지 500 µL를 커버슬립 상단에 추가합니다. 배지를 재사용하면 환경 변화로 인해 세포에 가해지는 스트레스를 줄일 수 있으며, 세포 외 분비 인자를 평가하는 데에도 유용할 수 있습니다. 배지를 추가한 후 배양 챔버 위에 유리 커버를 덮고, 70% 에탄올을 적신 Kim wipes로 커버슬립 바닥면에서 현미경 관찰을 방해할 수 있는 잔여물을 제거합니다.

배양 챔버를 34 °C, 5% carbon dioxide 인큐베이터에 30분 동안 둡니다. 이 단계는 챔버 자체를 34 °C로 가열하여 커버슬립의 이동을 줄이기 위함입니다. 금속이 가열됨에 따라, 다음 단계들을 수행하는 동안 주변 조명을 최대한 낮게 유지해야 합니다.

먼저, Thora는 이전에 실온에서 nuke view의 elequa를 준비하였습니다. 그 다음 인큐베이터에서 배양 챔버를 꺼내어 신속하게 현미경의 환경 챔버에 배치합니다. 듀얼 레귤레이터가 장착된 5% 혼합 이산화탄소 탱크를 켭니다.

다음으로, 현미경 램프를 약 2.5 V로 설정하고 노출 시간을 240 ms로 맞춘 상태에서 10배 대물렌즈를 사용합니다. 명시야 현미경을 사용하여 컴퓨터 모니터에 세포가 보이도록 초점을 맞춥니다. 그 다음, 연동 펌프를 이용한 느린 국소 관류 방식으로 배지를 교체하여 80 mM 농도의 칼륨 이온 또는 다른 세포 사멸 유도제를 세포에 첨가합니다.

nuke view 4 88 기판은 최대 36시간 동안 지속되는 실험을 위한 세포 배양 과정에서 안정적입니다. 따라서 이 시간 동안 실험을 수행할 수 있습니다. 먼저 적색 및 녹색 형광 단백질의 형광을 시각화할 수 있도록 현미경을 설정하십시오.

그런 다음 레드 채널을 클릭하여 형질전환된 세포를 표시합니다. 형질전환된 세포가 여러 개 관찰되는 프레임을 약 12개 선택하여 저장하고, 해당 XY 스테이지 좌표를 저장합니다. 저장된 스테이지 좌표에서 6분마다 명시야, 레드 채널 및 그린 채널 이미지를 캡처하도록 현미경을 설정합니다.

중복 또는 3회 반복 실험에서 여러 XY 지점을 수집한 후, 서로 다른 날에 수행된 개별 실험의 데이터를 취합하고, 서면 프로토콜에 기술된 대로 데이터 분석 및 통계 검정을 수행하여 CASP bay 음성 세포와 CASP bay 양성 세포의 비율을 비교합니다. Nuke view 4 88 기질은 N 19 oligo DDR 글리아 세포 배양의 아포토시스 속도 증가를 나타낼 수 있습니다. 고농도의 세포 외 칼륨 처리 후, 10배 대물렌즈를 사용하여 이러한 기저 이미지를 획득하였습니다.

N 19 세포에 RFP를 형질전환시킨 후, 대조군 세포에는 Nuke View 488 기질 3 µL를 처리하였고, 실험군 세포에는 Nuke View 488 기질 3 µL와 80 mM potassium을 처리하였습니다. 이 이미지들은 80 mM potassium 처리 후 3시간, 6시간, 9시간이 경과함에 따라 세포사멸 세포 수가 증가함을 보여줍니다. 대조군 조건에서는 80 mM potassium 처리 배양군과 비교했을 때 상당한 수준의 세포사멸이 관찰되지 않았습니다. 대조군 조건에서 관찰되는 배경 녹색 신호는 세포 외 potassium의 첨가 없이 세포사멸이 진행 중인 세포들을 나타냅니다.

신경계 손상과 관련된 연구에는 12시간의 시간 경과 관찰이 적절합니다. 12시간 후, 칼륨 처리된 배양물에서는 약 45%의 세포 사멸이 나타났습니다. 대조군 실험의 세포들은 12시간 시점에서 거의 세포 사멸(apoptosis)을 보이지 않았습니다. 다만, 다른 상황에서는 실험을 더 오래 진행해야 할 수도 있습니다.

이 그래프는 12시간의 실험 과정 동안 caspase three 양성 세포의 증가를 보여줍니다. 숙달되면 이 기법은 1시간 이내에 수행할 수 있으며, 적절히 수행될 경우 하룻밤 사이에 데이터를 수집할 수 있습니다. 이 절차를 시도할 때, 이후의 처리 과정 간에 일관성을 유지하는 것이 중요합니다.

연구 대상 경로에 관여하는 다른 하위 단백질을 관찰하기 위해 면역 염색과 같은 다른 방법들을 사용할 수 있습니다. 이 영상을 시청한 후에는 이미징을 위한 샘플 준비 방법을 충분히 이해하게 될 것입니다. 데이터 세트를 획득하고 데이터를 분석하십시오.