microfluidic 비말 플랫폼 형광 검출 방법

안녕하세요, 저는 Jersey입니다. 안녕하세요, 제 이름은 Shabi이며, 저희는 둘 다 임페리얼 칼리지 런던의 Andrew Di Melo 교수님과 Josh Del 박사님과 함께 미세유체 액적 플랫폼을 연구하고 있는 박사후 연구원입니다. 액적 기반 미세유체 플랫폼은 매우 정밀하게 정의된 부피로 생성될 수 있고, 생성 빈도가 초당 수 킬로헤르츠(kHz)에 달할 정도로 높기 때문에 더 높은 처리량의 실험을 수행할 수 있는 유망한 후보입니다.

또한, 관심 영역을 수 리터 정도로 작은 구획 내에 캡슐화할 수 있으므로, 크로스토크와 분산을 모두 제거할 수 있으며 분석 과정을 더욱 정확하게 타이밍할 수 있습니다. 저희 연구 그룹에서는 이미 마이크로 액적 플랫폼을 다양한 응용 분야에 성공적으로 적용해 왔습니다. 예를 들어, 중합효소 연쇄 반응, 나노입자 합성 및 단일 분자 세포 분석 등이 있습니다.

이러한 시스템 내에서 생성되는 방대한 양의 정보는 효율적으로 추출, 활용 및 이용되어야 합니다. 이러한 관점에서, 선택할 검출 방법은 적절해야 하며, 높은 민감도와 낮은 검출 한계를 제공하고, 다양한 분자 종에 적용 가능하며, 비파괴적이어야 하고, 미세유체 장치와 용이하게 통합될 수 있어야 합니다. 이러한 요구를 충족하기 위해, 본 연구진은 소량의 부피 환경에서 방대한 양의 물리적 정보를 추출할 수 있으며, 광범위한 물리적, 화학적 및 생물학적 대상의 분석에 적용 가능한 일련의 실험 도구와 프로토콜을 개발하였습니다.

본 프로토콜에서는 단일 세포 검출과 Dropbox 내 혼합 과정 매핑에 적용되는 두 가지 방법을 제시하겠습니다. 미세유체 칩은 전통적으로 포토리소그래피 방법을 사용하여 폴리디메틸실록산(PDMS)으로 제작됩니다. 미세유체 채널을 얻기 위해 이 공정은 클린룸 시설에서 수행되어야 합니다. 실리콘 웨이퍼 위에 SU-8 50을 스핀 코팅한 후, 핫플레이트에서 65°C와 95°C로 소프트 베이크하여 용매를 증발시키고 막을 치밀화합니다. 냉각 후, 적절한 마스크 하에서 SU-8 레지스트를 UV 방사로 노광하고, 다시 냉각 후 웨이퍼를 65°C와 95°C에서 베이크합니다.

교반하면서 적절한 현상액을 사용하여 노광되지 않은 영역을 현상합니다. 신선한 EC 용매로 웨이퍼를 헹군 다음 가스로 건조하여 깨끗한 표면을 생성합니다. 헥산과 메탄올 세척으로 웨이퍼를 처리합니다.

또한 마스터 제작 공정을 완료하기 위해, 데시케이터 내에서 표면에 고정제를 40분 동안 증착합니다. 구조화된 미세유체 기판을 형성하기 위해, 수지 가교제를 10:1 비율로 섞은 S guard 1 8 4를 마스터 위에 도포합니다. 이를 데시케이터에서 탈기하고, 장치를 65 °C에서 경화시킵니다.

경화된 PDMS를 절단하고 마스터에서 떼어냅니다. 바이옵시 펀치를 사용하여 유체 튜브를 연결할 액세스 홀을 만듭니다. PDMS 층을 추가로 도포하여 65°C에서 20분 동안 경화시킵니다.

준비된 상층부를 하층부 위에 올리고 65°C에서 하룻밤 동안 경화시킵니다. 페트리 접시에서 칩을 떼어내어 깍둑썰기하듯 자릅니다. 칩 제작이 완료되면, 분석하고자 하는 용액을 주입하여 사용할 수 있습니다.

시린지에 필요한 용액을 채우고, 튜빙의 어느 부분에도 기포가 남아 있지 않도록 합니다. 액적 생성에는 두 가지 상이 사용됩니다. 수성 분산상에는 분석 대상 시약이 포함되어 있습니다.

오일 상은 연속상 역할을 합니다. 주사기 바늘 팁과 내부 직경이 동일한 튜빙을 바늘 한쪽 끝에 연결하고, 주사기를 주사기 펌프에 장착한 후 원하는 주입 유량을 설정하십시오. 각 상에 대해, 수성 상에 의한 PDMS의 젖음 현상으로 인해 액적 형성이 불안정해지는 것을 방지하기 위해 오일 대 수성 유량의 최소 비율을 1로 유지하는 것을 권장합니다. 튜빙의 반대쪽 끝을 PDMS 기판에 뚫린 구멍에 직접 연결하십시오.

더 복잡한 솔루션의 경우, 실리카, 모세관 포트 또는 커넥터를 구현할 수 있습니다. 칩의 배출 포트를 튜빙에 연결하고 폐액 수집 또는 추가 분석 처리를 위해 수집기로 유도하십시오. 설정이 완료되면, 두 가지 유입 유체를 결합시키기 위해 이러한 기하학적 구조를 사용함으로써 발생하는 전단력과 그에 따라 계면에서 발생하는 모세관 불안정성의 결과로, 액적을 생성하기 위한 마이크로채널의 두 가지 주요 구성인 흐름 집중(flow focusing) 또는 T-접합(T junction) 형식을 사용할 수 있습니다.

수 펨토리터(femtoliter) 정도로 작은 단분산 액적들이 자발적으로 생성됩니다. 액적이 생성되면 광학 장치를 사용하여 분석할 수 있습니다. 광학 시스템은 다음 프로토콜에 따라 구성합니다.

자동 서브마이크론 위치 결정 기능과 사용된 형광체의 흡수 파장에 맞는 파장에서 작동하는 레이저가 장착된 공초점 현미경을 사용하십시오. 형광 수명 이미징을 위해 수 MHz의 반복률로 작동하는 펄스 레이저를 사용하여 형광체를 여기시키십시오. 가래 실험에서는 빔 조향 거울과 광학계를 사용하여 빔 방향뿐만 아니라 빔 높이를 제어합니다.

이색 거울(dichroic mirror)을 사용하여 레이저 빔을 대물렌즈로 반사시킵니다. 두 개의 레이저를 동시에 사용하는 경우, 듀얼 밴드 이색 거울을 설치할 수 있습니다. 두 레이저 빔의 반사를 가능하게 하려면, 무한 보정 고개구수(NA) 현미경 대물렌즈를 사용하여 레이저 광을 미세유체 채널 내의 좁은 초점으로 모읍니다.

동일한 고개구수(high NA) 대물렌즈를 사용하고 동일한 다이크로익 미러를 통해 투과시켜, 미세유체 채널 내 샘플에서 방출되는 형광을 수집합니다. 단일 또는 이중 밴드 방출 필터를 사용하여 잔류 여기광을 제거합니다. 형광 방출광을 75 µm 핀홀에 초점을 맞춥니다.

평볼록 렌즈를 사용합니다. 핀홀을 현미경 대물렌즈의 공초점 평면에 위치시킵니다. 또 다른 다이크로익 미러를 사용하여 형광 신호를 두 개의 검출기로 분리합니다.

다이크로익 미러에 의해 반사된 형광을 방출 필터로 필터링하고, 평볼록 렌즈를 이용해 첫 번째 검출기에 초점을 맞춥니다. 보조 적색 형광체가 포함된 실험의 경우, 다이크로익 미러를 투과한 형광을 또 다른 방출 필터로 필터링한 후, 다른 평볼록 렌즈를 사용하여 두 번째 검출기에 초점을 맞춥니다. 형광 광자 검출에는 아발란체 광다이오드를 사용하십시오.

형광 데이터 획득을 위해, avalanche photo diode 검출기의 전자 신호를 개인용 컴퓨터에서 작동하는 데이터 로깅용 다기능 DAQ 장치에 연결하십시오. 가래 실험의 경우, 펄스 레이저를 사용하고 검출기를 별도의 PC에서 작동하는 시간 상관 단일 광자 계수(time correlated single photon counting) TCS PC 카드에 연결하십시오. 이 카드를 통해 형광 수명 데이터를 얻을 수 있습니다.

TCS PC 방법론을 사용하여, 검출된 각각의 형광 광자를 입사 레이저 펄스와 상관시키며, 따라서 방출된 각 형광 광자에 지연 시간이 할당됩니다. 이 데이터는 단일 또는 다중 지수 감쇠 곡선에 피팅하여 형광체의 복사 속도 추정치를 얻을 수 있습니다.

우리는 이제 세포가 생물학적, 물리적 그리고 화학적 관점 모두에서 매우 이질적이라는 것을 알고 있습니다. 따라서 이상적으로는 각 세포를 하나씩 분석해야 합니다. 하지만 신뢰할 수 있고 의미 있는 결론을 도출하기 위해 충분한 정량적 정보를 수집하려면, 분석은 더 높은 처리량으로 수행되어야 합니다.

여기 단일 액적 내에 E. coli 세포를 캡슐화하는 예시가 있으며, 이를 통해 실험을 수행할 수 있습니다. 하룻밤 동안 배양한 E. coli Top 10 균주를 사용하십시오. 세포의 생존력을 검출하기 위해 cyto nine과 propidium iodide를 사용하십시오.

두 염료 모두 DNA 삽입 염료(intercalating dyes)이며, 형광 강도가 20배 이상 증가합니다. DNA에 결합하면 cyto nine은 세포막 투과성인 녹색 형광 염료로 나타나며, propidium iodide는 세포막 비투과성인 적색 형광 염료로 나타납니다.

따라서 살아있는 세포는 녹색 형광을 나타내고, 죽은 세포는 녹색과 적색 방출을 모두 나타냅니다. 여기에서는 T-접합(T junction)을 이용한 액적 생성 및 단일 세포 캡슐화를 확인할 수 있습니다. 이 영상은 고속 카메라로 촬영되었으나, 실제 액적은 초당 수천 개의 속도로 생성될 수 있습니다.

세포를 캡슐화할 때는 세포 배양액을 희석하여 생성되는 액적보다 세포 수가 적도록 해야 하며, 시린지나 튜브 내에서 발생할 수 있는 세포 침전이 방지되어야 합니다. 시린지 내부에 마그네틱 스터 바를 사용하여 세포가 용액 속에 균일하게 분산되도록 유지하십시오. 시린지와 마이크로칩을 연결하려면 50 µm의 매우 가는 튜브를 사용하십시오.

이는 튜브 내부의 빠른 유속을 보장하여 세포가 침전되는 것을 방지합니다. 다음은 세포 기반 실험에서 시간에 따른 광자 수의 전형적인 예시입니다. 이는 액적 내의 혼합 과정을 매핑하기 위한 것입니다.

수명이 서로 다른 두 가지 형광 물질을 사용하여 액적을 생성할 수 있습니다. 흐르는 액적 내에서는 유동장이 형성되며, 이는 결과적으로 처음에 분리되어 있던 두 용액을 혼합하여 혼합 과정을 촉진합니다. 구불구불한 채널을 사용하면 유동장의 대칭성을 변경할 수 있습니다.

액적을 측정하기 위해, 액적이 흐르는 미세유체 채널 높이의 절반 지점에 광학 프로브 볼륨을 맞춥니다. 채널의 한쪽 끝에서 시작하여 채널 전체 너비에 걸쳐 1 µm 간격으로 각 실험을 수행하십시오. 액적과 관련된 단일 버스트(burst)를 오일 상의 노이즈 배경과 구분하고, 각 버스트의 지속 시간을 결정하는 알고리즘을 구현하십시오.

실험이 수행된 특정 너비에서 각 액적의 길이를 따라 지연 시간과 강도 값을 추출하는 두 번째 알고리즘을 구현하십시오. 그런 다음 최대 우도 추정법(MLE) 알고리즘을 사용하여 실험에 사용된 각 액적의 형광 수명을 평가하십시오. 실험에 사용된 모든 액적의 수명 값들을 평균하면 MLE 계산의 최종 오차를 줄일 수 있습니다.

더 많은 액적을 분석할수록 수명 궤적을 확보한 후의 오차가 줄어듭니다. 각 너비에 대해 모든 궤적을 2D 맵으로 결합하십시오. 각 수명 값은 두 형광 색소의 특정 혼합 비율과 연관되므로, 이를 통해 농도 또는 혼합 맵을 얻을 수 있습니다.

본 연구에서는 마이크로 소자의 제작과 실험 장치, 그리고 마이크로 액적 형성 및 영역 캡슐화와 액적으로부터 발생하는 해당 과정의 광학적 검출을 위한 관련 프로토콜에 대해 설명하였습니다. 선정된 두 가지 예시는 액적 내 단일 세포의 검출과 액적 내부의 혼합 과정 매핑입니다. 이는 현재 액적 미세유체 기술을 통해 연구되고 있는 일반적인 응용 분야를 나타냅니다.

제시된 실험에서 알 수 있듯이, 액적 미세유체 플랫폼의 사용은 완벽한 가둠 효과와 더 높은 재현성으로 인해 높은 처리량과 같은 몇 가지 매력적인 특성을 나타냅니다. 생성되는 정보의 양이 방대하고 정보 생성 속도가 매우 빠르기 때문에, 이러한 소형화된 플랫폼의 장점을 최대한 활용하기 위해서는 매우 높은 시공간 해상도를 갖춘 빠른 검출 방법의 사용이 필요합니다.

본 사례에서, 우리는 고정밀 불소 분광법 기술을 사용하여 이것이 가능하다는 것을 입증합니다.