2D 및 3D 환경에서 신경 전구 세포의 전기장 제어 감독 마이 그 레이션

이 실험 절차의 전반적인 목표는 2D 배양 및 3D ex vivo 모델에서 인가된 전기장이 신경 전구 세포의 이동에 미치는 영향을 기록하는 것입니다. 이를 위해 먼저 in vitro에서 신경 전구 세포를 분리하고 증식시킵니다. 두 번째 단계는 신경 전구 세포의 단일 세포 현탁액을 준비하는 것입니다.

다음으로, 2D 배양 준비를 위해 신경 전구 세포를 맞춤 설계된 전기 촉진 챔버에 도말합니다. 또는 3D ex vivo 모델 준비를 위해 신경 전구 세포를 hooks 3, 3, 3, 4, 2로 표지하고 척수 절편 기관 유사 모델에 주입합니다. 최종적으로, 전기 챔버에 전기장을 가하고 타임랩스 기록을 수행하여 2D 및 3D 환경 모두에서 전구 세포가 전기장의 음극 방향으로 이동함을 보여줍니다.

이 기술의 주요 장점은 자연 환경과 매우 유사한 3D 장기모사 모델에 이식된 개별 세포의 전기장 유도 이동을 실시간으로 추적할 수 있는 새로운 방법을 제공한다는 것입니다. 이 방법은 척수 슬라이스에 이식된 신경교 세포의 이동과 같은 전기적 기술에 대한 통찰을 제공할 뿐만 아니라, 소형 뇌 슬라이스 모델과 같은 다른 시스템에도 적용될 수 있습니다. 이 절차를 시작하려면, 22 by 22 millimeter 크기의 오토클레이브 유리판을 나누어 22 by 11 millimeter 크기의 유리 스트립을 준비하십시오.

다이아몬드 펜을 사용하여 1번 두께의 커버 슬립을 절반으로 자릅니다. 다음으로, 22 x 11 mm 크기의 스트립 4개를 고진공 실리콘 그리스로 수직으로 접착하여 내부 치수가 22 x 10 mm인 독립형 유리 웰을 제작하고, 웰이 하룻밤 동안 완전히 건조 및 경화되도록 둡니다. 다음 날, 실리콘 그리스를 사용하여 22 x 11 mm 유리 스트립 2개를 10 mm 간격을 두고 서로 평행하게 100 mm 배양 접시 바닥에 부착합니다.

그런 다음 실리콘 그리스를 사용하여 22 by 22 millimeter 커버슬립을 부착함으로써 이 스트립들 사이의 영역을 밀봉합니다. 유리 웰을 커버슬립 위에 배치하여 내부 벽이 세포 파종을 위한 밀폐된 공간을 형성하도록 합니다. 모든 접합부를 실리콘 그리스로 방수 처리합니다.

동반된 원고에 기술된 대로, 이 제한된 영역을 poly-D-lysine으로 순차적으로 코팅한 후 laminin을 코팅합니다. 이 절차에서는 E 14에서 E 16 마우스의 뇌를 적출하여 차가운 D-M-E-M-F 12 기본 배지에 넣습니다. 다음으로, 해부 현미경 하에서 뇌막을 제거합니다.

그 후, 뇌 조직을 35mm 페트리 접시에 옮깁니다. 미세 핀셋을 사용하여 뇌 조직을 조직 조각으로 분리합니다. 그런 다음, 분리된 조직을 15mL 원심분리관으로 옮깁니다.

D 잔해를 제거하기 위해 샘플을 800 RPM에서 3분 동안 원심 분리합니다. 다음으로, BFDF와 DGF가 포함된 A-D-M-E-M-F 12를 샘플에 첨가합니다. 1mL 피펫을 사용하여 이를 트라이툴레이션(tritration)합니다.

그 다음 셀 스트레이너를 사용하여 단일 세포 현탁액을 얻습니다. 플라스크에 ml당 20,000~50,000개의 세포가 되도록 분주합니다. 이후 3일마다 전체 배지 교체를 수행하며, 이때 세포를 1,300 RPM에서 5분 동안 원심분리합니다.

상층액을 제거하고, 신선한 배지에 PT를 현탁한 후, 최소 5회 이상 매 6일마다 세포를 플라스크로 되돌려줍니다. NEUROSPHERES를 15 mL 튜브로 옮겨 1,500 RPM에서 5분 동안 원심 분리합니다. 상층액을 제거합니다.

펠릿을 trips in EDTA에 재현탁하여 단일 세포 현탁액을 만듭니다. 세포 수를 측정하기 전, 10,000개의 세포를 포함하는 1mL의 현탁액을 준비합니다. 그 다음, 유리 웰에서 라미닌을 제거하고 완전히 건조시킵니다.

이를 1 mL의 세포 현탁액으로 교체합니다. 그 후, 세포가 부착될 수 있도록 배양 접시를 37 °C 인큐베이터에 최소 4시간 동안 둡니다. 세포가 충분히 합쳐지면(confluent), 챔버에서 배지를 제거합니다.

유리를 조심스럽게 제거합니다. 그다음, 실리콘 그리스를 사용하여 22 by 11 millimeter 스트립 2개 사이에 오토클레이브 처리된 22 by 22 millimeter 유리 커버슬립을 조심스럽게 부착하여 세포 위에 지붕을 형성합니다. 세포가 건조해지는 것을 방지하기 위해 배지를 몇 방울 떨어뜨려 세포를 덮어주어야 함을 기억하십시오.

그 다음, 배양 접시의 한쪽 끝에서 반대쪽 끝까지 두 개의 수밀성 실리콘 그리스 차단벽을 만들어 챔버의 양 끝에 독립된 배지 저장소를 형성합니다. 챔버를 신선한 배지로 채워 한쪽 배지 저장소에서 다른 쪽 저장소로 흐름이 이어지도록 합니다. 이후, 세포 회복을 위해 배양 접시를 인큐베이터에 넣고 12시간 동안 배양합니다.

다음 단계로, 마이그레이션 챔버의 각 리저버(reservoir) 위에 구멍이 오도록 두 개의 구멍을 뚫어 디쉬를 덮을 뚜껑을 준비합니다. 그 다음, 챔버 내의 배지를 25 mM HEPES 버퍼가 포함된 배양 배지로 교체합니다. 이후, 디쉬를 온도 제어 이미징 시스템으로 옮깁니다.

타임랩스 및 다중 위치 기록을 위한 실험 파라미터를 설정합니다. 현미경으로 관찰하고 이미징 시스템으로 기록할 때 전기장 벡터가 수평으로 형성되도록, 음극과 양극이 각각 왼쪽과 오른쪽에 오도록 챔버를 정렬합니다. 다음으로, 비커 두 개를 채웁니다.

Steinberg 용액을 준비합니다. 미리 준비한 2% Steinberg 한천 용액이 채워진 유리 브리지를 사용하여 각 배지 저장조에 별도의 비커를 연결합니다. 그런 다음 DC 전원 공급 장치에 연결된 은 전극을 Steinberg 용액에 넣습니다.

각 비커에서 전원 공급 장치의 전압 다이얼을 0으로 맞춘 후 전원을 켭니다. 전압 다이얼을 올리면서 전압계로 전기 촉진 챔버 양단의 전압을 측정합니다. 그런 다음 실험 요구 사항에 맞게 전압을 조정합니다.

그 후, 타임랩스 녹화를 시작하십시오. 배지를 교체하고 필요에 따라 전압을 다시 조정하십시오. 매시간 필요에 따라 신선한 배지, 약물 또는 화학제를 저장조에 추가할 수 있습니다.

배양 접시 뚜껑에 각 배지 저장소 위에 위치하도록 추가로 뚫은 구멍들을 사용합니다. 이 단계에서는 2주 된 생쥐의 요추 척수를 적출합니다. 그 후 해부 현미경 하에서 machel wane 조직 절단기를 사용하여 척수를 500 micron 두께의 절편으로 자릅니다.

절편들을 분리하고 시상-축상 척수 구조가 온전한 것을 선택합니다. 그다음 30 µL의 MA gel이 담긴 100 millimeter 페트리 접시에 절편들을 배치합니다. 가능한 한 중심에 가깝게 배치하십시오.

이들을 37°C의 5% 이산화 탄소 배양기에서 최소 30분 동안 배양합니다. Matrigel 단백질이 자기 조립되어 척수 절편의 표면을 덮는 얇은 막을 형성하려면, Matrigel이 완전히 조립되는 것이 매우 중요합니다. 필요한 경우 페트리 접시를 37°C에서 30분 더 배양한 후, 25 mM HEPES 완충액과 15~20% 태아 송아지 혈청이 함유된 4~6 mL의 DMEM/F-12 배지를 첨가합니다.

배지가 슬라이스 위로 직접 흐르지 않도록 매우 조심스럽게 처리하며, 슬라이스가 배지에 완전히 잠기지 않아 가지 표면이 공기에 충분히 노출되도록 합니다. 배지는 일주일에 두 번 교체합니다. 이제 신경 전구세포 현탁액을 5 µM hooks가 포함된 배지에서 배양합니다.

3, 3, 3, 4, 2로 30분 동안 처리합니다. 현미경 하에서 모세관 유리 튜브를 사용하여 2 µL의 현탁액을 척수 절편에 미세 주입합니다. 모세관 유리 튜브가 매트리젤을 통과하여 척수 절편 내부까지 도달하도록 천천히 주입하십시오.

세포 현탁액이 생기는 것을 방지하기 위해 유리관을 척수 절편 내부에 최소 30초 동안 유지하십시오. 이후 척수 절편이 담긴 페트리 접시를 37 °C, 5% CO2 조건의 배양기에 넣고 하룻밤 동안 배양합니다. 다음 날, 500 mV/mm의 전기장을 가하기 전, 3 3 3 4 2로 표지된 신경 발생 세포가 포함된 척수 절편 주변에 전기 유도 챔버를 구축하십시오.

여기서 신경 전구 세포는 전기장에 노출되었을 때 음극을 향해 매우 지향적인 이동을 보이며, 빨간색 선과 파란색 화살표는 각각 세포 이동의 궤적과 방향을 나타냅니다. 그리고 여기 이동 경로를 나타낸 도표가 있습니다. 여기에는 hooks 3 3, 3, 4 2로 라벨링된 신경 전구 세포들이 있습니다.

이들은 전기장 처리 시작 시점에 기관형 척수 절편으로 이식되었습니다. 신경 전구 세포가 음극 방향으로 2.5시간 동안 방향성 이동을 한 후, 전기장의 극성을 반전시켰습니다. 전기장 극성의 변경은 새로운 음극을 향한 축삭의 급격한 방향 전환을 유도하였습니다.

여기 척수 절편 내에 이식된 신경 전구세포의 이미지입니다. 타임랩스 기록 종료 후, 척수 절편 내에 이식된 신경 전구세포의 3D 재구성 모습이 여기에 나타나 있습니다. 질량 숙달 완료.

이 기술은 적절하게 개발된 이후, 올바르게 수행한다면 2주 안에 완료될 수 있습니다. 이 기술은 이제 세포 생물학 분야의 연구자들이 전기장에 반응하는 신경 전구 세포의 이동을 2D 및 3D 배양 시스템에서 탐구하고 적용할 수 있는 길을 열어줍니다.