내생 NADH 형광의 2 광자 이미징에 의한 마우스 대뇌 피질의 Microregional Hypoxia의 탐지

이 프로토콜의 전체적인 목적은 생체 내(in vivo) 마우스 피질에서 미세 영역 조직 저산소증을 직접적으로 시각화하는 것입니다. 이를 위해 먼저 마취된 마우스에 개두술을 통해 두개창을 준비합니다. 그 다음, 뇌혈관을 표지하기 위해 형광 염료를 정맥 주입합니다.

마지막으로, 내인성 NADH 형광과 형광 표지된 피질 미세혈관의 광자 이미징을 동시에 수행합니다. 최종적으로, 니코틴아미드 아데닌 디뉴클레오타이드의 환원형 존재 여부를 시각화함으로써 뇌 실질의 미세 영역에서 발생하는 기능적 저산소증을 보여주는 결과를 얻을 수 있습니다. Clark 방식의 전극과 같은 기존 방법과 비교했을 때 이 기술의 주요 장점은 넓은 시야 범위에서 높은 공간 분해능을 제공하며, 침습성이 더 낮다는 점입니다.

이 방법은 두 개의 형광 채널을 갖춘 표준 응용 이광자 시스템에서 수행할 수 있습니다. 안녕하세요, 로체스터 대학교 미생물학 및 면역학 교수이자 학과장인 Steve Hurst입니다. 오늘 절차를 시연할 분들은 Kishka 연구소의 Anita's son과 제 연구실의 연구 조교수 Oxana Paulka입니다. NADH 이미징 기술을 개척한 Dr.Kishka는 최근 독일에로 거처를 옮겨 오늘 이 자리에 함께하지 못했습니다. 오토클레이브 처리하거나 70%ethanol로 소독한 필수 기구들로 수술 부위를 준비하고, 마우스를 5%isof fluorine으로 마취시킨 후, 가열 패드 위에 올리고 페이스 마스크를 통해 공기 중 1.3에서 1.5%isof fluorine을 투여하십시오.

꼬리 꼬집기(tail pinch)를 통해 마취 수준을 확인합니다. 다음으로, 직장 프로브를 삽입하여 절차 전반에 걸쳐 동물의 체온을 지속적으로 측정합니다. 마우스의 눈이 건조해지는 것을 방지하기 위해 인공눈물 겔을 도포합니다.

그다음 머리와 양쪽 허벅지의 털을 제거합니다. 허벅지의 남은 털을 제거하기 위해 제모제를 허벅지에 2분간 도포하며, 허벅이는 옥시메트리(oximetry) 측정에 사용될 것입니다. 마지막으로 10% povidone iodine 용액과 70% ethanol을 사용하여 두피를 소독합니다. 가위로 두개골에서 5mm 떨어진 지점부터 절개하여 크레이니얼 윈도우(cranial window)를 만듭니다.

두피에 절개를 가한 후 1cm 정도 전진시킵니다. 피부를 양옆으로 젖혀 두개골을 노출시키고 두개골 상단의 막을 제거합니다. 10% ferric chloride 용액을 도포합니다.

과잉 용액을 닦아내고 45도 각도로 막을 긁어냅니다. 다섯 번째, 핀셋을 사용합니다. 해부 현미경을 사용하여 관심 영역을 확인합니다. 헤드 플레이트 창의 가장자리를 따라 래피드 글루를 얇게 도포합니다.

관심 영역이 윈도우에 노출되도록 헤드 플레이트를 배치하고 헤드 플레이트에 가벼운 압력을 가합니다. 접착제가 빠르게 중합될 수 있도록 소량의 치과용 시멘트를 도포합니다. 접착제가 중합되는 동안 10초 동안 유지합니다.

헤드 플레이트와 두개골을 밀봉하기 위해 창의 가장자리에 소량의 급속 접착제를 도포합니다. 그런 다음 해부 현미경 하에서 헤드 플레이트를 동물 홀더에 나사로 고정합니다. 이때 6,000 RPM으로 설정된 micro torque two 드릴 세트와 IRF 0 0 5 드릴 비트를 사용합니다.

두개골과 헤드 플레이트에서 모든 여분의 접착제를 제거하십시오. 그런 다음 드릴을 1,000 RPM으로 설정하고, 헤드 플레이트 창 내부에 직경 약 5 mm의 원을 그리며 두개골을 천공하기 시작하십시오. 매우 부드러운 연필로 그림을 그리듯 가볍게 쓸어내리는 동작을 사용하십시오.

20~30초마다 드릴링을 멈추고 압축 공기를 사용하여 골분을 제거하십시오. 드릴링이 진행됨에 따라 중앙의 온전한 두개골 주변으로 구멍이 형성됩니다. 얇은 두개골을 뚫지 않도록 주의하면서, 이 구멍의 두께가 일정하게 유지되도록 하십시오.

또한, 굵은 혈관 주변에서는 각별히 주의하십시오. 혈관이 손상되어서는 안 되며, 가능하다면 접촉조차 하지 않아야 합니다. 핀셋의 한쪽 끝을 이용하여 윈도우 중앙의 뼈를 들어 올린 후, 윈도우 위에 인공 뇌척수액 한 방울을 떨어뜨립니다. 킴와이프(Kim wipe)의 모서리를 사용하여 45도 각도로 인공 뇌척수액을 부드럽게 닦아냅니다.

다섯 번째로, 핀셋입니다. 윈도우 가장자리를 따라 손상된 경막 부위를 찾아 들어 올려 제거합니다. 출혈이 발생하면 인공 CSF를 한 방울 떨어뜨리고, 미세 출혈이 멎을 때까지 2~3분 동안 기다립니다.

다음으로, 인공 뇌척수액에 용해된 0.07% 저융점 agarose 10 milliliters를 준비합니다. 용해된 agarose를 체온까지 데웁니다. 뇌 표면에서 과잉의 인공 뇌척수액을 닦아냅니다.

윈도우에 에어로젤(aero)을 붓고 유리 슬라이드로 덮습니다. 그다음 유리를 가볍게 눌러 유리와 헤드 플레이트가 접촉하게 하고, 에어로젤이 고체 상태가 될 때까지 10~20초 동안 기다립니다. 핀셋과 부드러운 티슈 페이퍼를 사용하여 유리 커버에서 과잉 에어로젤을 제거합니다.

유리 부분을 헤드 플레이트에 접착하기 위해 유리 주변에 소량의 급결 접착제를 바릅니다. 그 다음, 대퇴정맥에 주입할 접착제를 고정시키기 위해 소량의 치과용 시멘트를 도포합니다. 동물을 부분적으로 돌려 왼쪽 허벅지 안쪽이 드러나게 합니다.

테이프를 사용하여 동물을 고정합니다. 이 상태에서 피부에 살균 세정제를 바른 후, 100% ethanol을 도포합니다. 다음으로, 무릎부터 치골 결합까지 허벅지 내측을 따라 절개합니다.

필요한 경우, 둔성 박리를 통해 연조직을 분리하십시오. 1mL 주사기에 Texas red 130 µL를 채웁니다. 새로운 30G 바늘을 장착하고, 베벨(bevel)이 위를 향하게 한 상태에서 30도 각도로 조심스럽게 구부립니다.

해부 현미경 하에서 바늘에 Texas Red 용액을 채운 후, 바늘을 대퇴정맥에 삽입하고 100 µL의 Texas Red를 주입합니다. 바늘을 제거하고 거즈로 정맥을 가볍게 눌러 지혈합니다. 혈중 산소 포화도의 지속적인 모니터링을 위해 4-0 봉합사로 피부를 봉합합니다.

제모를 마친 오른쪽 허벅지에 옥시미터 프로브를 부착합니다. 이미징을 시작하려면, 수술적으로 준비된 마우스를 현미경 스테이지로 옮깁니다. 고배율 광자 이방성(photon anisotropy) 등록을 위한 참조 맵으로 사용하기 위해, Bright Field 조명과 4배 배율로 두개골 창(cranial window) 부위의 초기 사진을 촬영합니다.

10배율을 사용하여 관심 영역을 확대합니다. 피질층에서 관심 영역을 선택합니다. 시계열 기록을 시작하기 위해 하나 또는 두 개를 선택합니다.

이미지 품질을 높이기 위해 평균 3~5개의 프레임을 사용할 것을 권장합니다. 다음으로, 동물이 호흡하는 공기에 50% 질소를 첨가하여 저산소혈증을 유도합니다. 이렇게 하면 산소 농도가 10%가 됩니다. 옥시미터 데이터를 모니터링하여 저산소혈증 상태를 확인하십시오.

저산소증 동안 약 30초 동안, 그리고 정상 산소 수치가 회복된 후까지 시계열 기록을 계속합니다. 혈관 주변의 저산소 조직 및 산소화된 조직 실린더의 영역을 검출, 측정 및 정량화하여 산소 분포 계산을 위한 데이터를 수집하십시오. 조직 실린더 반경 R을 결정하려면, 혈관의 중심과 높은 NADH 형광이 검출되는 경계 사이의 거리를 측정하십시오.

데이터 처리 방법은 서면 프로토콜을 참조하십시오. 이 그림은 일시적 저산소혈증 동안 비디오로 기록된 NADH 및 지형 이미지의 동시 촬영 결과이며, 이때 흡입 산소 농도를 3분 동안 21%에서 10%로 낮추었습니다. 실험적으로 유도된 이러한 수준의 저산소혈증은 대뇌 피질에 심각한 저산소증을 유발하기에 충분합니다.

저산소증으로 인해 초기에는 동맥 혈류 공급원에서 가장 먼 영역부터 NADH 형광(녹색으로 표시)이 증가했습니다. 빨간색으로 표시된 피질 미세순환으로부터의 산소 확산의 관찰 가능한 조직 경계를 나타내는 NADH 조직의 뚜렷한 경계에 주목하십시오. 여기는 빨간색으로 표시된 피질의 형광 표지된 미세혈관과 녹색으로 표시된 피질 회백질의 내인성 NADH 형광이 동시에 나타난 이미지이며, NADH 형광 강도 분포는 이진적입니다.

NADH 형광이 균일하게 낮은 영역과 NADH 형광이 균일하게 높은 영역이 있습니다. 노란색 선은 NADH 형광이 낮은 영역과 높은 영역 사이의 조직 경계를 나타냅니다. 이러한 조직 경계는 인접한 미세혈관과 공간적 관계를 보입니다.

이 관계는 미세혈관에서 조직으로의 산소 확산에 의해 결정됩니다. 어떤 경우에는 파란색 선으로 표시된 바와 같이, 이러한 조직 경계의 원통형 특성 또는 CRO 조직 실린더를 직접 확인할 수 있습니다. 여기서 조직 경계는 동심원 형태의 중앙 혈관을 가진 원형입니다.

이 기술은 적절히 수행될 경우 1.5시간 이내에 완료할 수 있습니다. 이 절차를 시도할 때, 부종으로 인한 피질 표면의 수직 이동을 방지하기 위해 커버 글라스를 금속판에 접착하는 것이 중요함을 기억하십시오. 이 절차 이후에는 조직 저산소증과 뇌혈관 결합 사이의 관계와 같은 추가적인 의문을 해결하기 위해 기능적 충혈 측정과 같은 추가 분석을 수행할 수 있습니다.

이 영상을 시청한 후에는 마우스 피질에서 미세 지역 조직 저산소증을 시각화하는 방법에 대해 충분히 이해하게 될 것입니다.