두피 네트워크 개발에 기능성 칼슘 이미징

이 영상의 전반적인 목적은 칼슘 민감성 형광 지표를 사용하여 발달 중인 피질 뇌 절편의 네트워크 활동을 측정하는 방법을 시연하는 것입니다. DY 뇌 절편은 어린 생쥐의 발달 중인 내장 피질에서 제작됩니다. 뉴런과 성상교세포 모두에 칼슘 의존성 마커가 로딩됩니다.

칼슘 의존성 염료의 형광 변화는 세포 활동의 변화를 반영합니다. 성상교세포, 미세아교세포 및 내피세포를 포함한 비신경세포는 특정 마커 염료를 사용하여 염색할 수 있습니다. 피질 네트워크 활동은 타임랩스 다광자 이미징을 통해 기록하며, 관심 영역의 3D 이미지 스택을 생성하여 네트워크 내의 세포를 검출합니다.

여러 세포에 걸친 세포 형광의 변화를 분석하여 발달 중인 피질 네트워크의 활성을 읽어낼 수 있습니다. 발달 중인 신경계의 전형적인 활성 패턴은 자발적인 동기화 네트워크 활성입니다. 동기화된 활성은 온전한 척수 피질 및 해리된 뉴런 배양 준비물을 포함하여 발달 중인 다양한 뉴런 영역에서 관찰되었으며, 자발적 활성 기간 동안 뉴런이 탈분극되어 단일 스파이크나 활동 전위의 버스트를 발생시키고, 전압 개폐 칼슘 채널을 포함한 많은 이온 채널을 활성화하여 칼슘 유입을 유도합니다.

전극 또는 다중 전극 어레이를 사용하여 국소 네트워크로부터 매우 동기화된 활동이 측정되었습니다. 이러한 방식은 높은 시간적 샘플링 속도를 가능하게 하지만, 세포 활동의 통합 판독으로 인해 공간 해상도는 낮습니다. 단일 뉴런의 패치 클램프 전기 생리학을 사용하여 발화율을 측정함으로써 신경 활동의 단일 세포 해상도를 구현할 수 있습니다.

하지만 네트워크로부터 측정할 수 있는 능력은 동시에 패치(patch)된 뉴런의 수로 제한되며, 일반적으로는 단 하나 또는 두 개의 뉴런에 불과합니다. 칼슘 의존성 형광 지시 염료의 사용을 통해 세포 네트워크 전체의 동기화된 활동을 측정할 수 있게 되었습니다. 이 기술은 높은 공간 해상도와 충분한 시간적 샘플링을 모두 제공하여 발달 중인 네트워크의 자발적 활동을 기록할 수 있게 합니다.

URA 2:00 AM ester와 같은 형광 칼슘 민감성 지표는 칼슘 이온과 결합할 수 있는 카복실산 그룹을 포함하고 있습니다. 이러한 형광 염료는 단광자 또는 이광자 현미경을 사용하여 특정 빛의 파장에 의해 활성화됩니다. 염료에서 방출되는 광자의 수는 칼슘과 결합함에 따라 일시적으로 변화합니다.

광자 수 또는 형광의 이러한 변화는 delta FF 신호로 보고되며, 이는 뉴런 내 칼슘 농도의 변화에 해당합니다. 칼슘 민감성 지표의 변화를 측정하는 것은 발달 중인 세포의 네트워크 활동 패턴을 읽어내는 유용한 측정 방법입니다. 안녕하세요, 저는 Rianna Morty이고, 제 이름은 Julie Abbots입니다.

저희는 암스테르담 대학교의 해석 신경생리학과 소속입니다. 저희는 다초점 이미징(multifocal imaging) 환경에서 칼슘 민감성 지표를 사용하여 생쥐 피질의 발달 중인 조직 내 기능적 활성을 연구하기 위해 칼슘 이미징을 활용해 왔습니다. 이 짧은 영상의 목적은 이러한 방법들을 사용하여 신경계의 발달 중인 네트워크에서 자발적 및 유발 활성 패턴을 모두 측정하는 방법을 시연하는 것입니다.

신경 회로의 손상을 줄이기 위해 어린 생쥐의 두개골에서 뇌를 빠르게 제거합니다. 얼음처럼 차가운 슬라이스 용액 내에서 뇌를 해부합니다. 이 슬라이스 용액은 뉴런 기록용 ACSF에 일반적으로 사용되는 나트륨 대신 콜린 염화물을 포함하고 있습니다.

본 실험에서는 발달 중인 생쥐 뇌의 내장 피질에서 뇌 절편을 제작합니다. 페트리 접시 위에 거름종이 한 조각을 놓고 A TSF 수 밀리리터를 뿌려 적십니다. 뇌를 거름종이 위로 옮깁니다.

단일날 면도날을 사용하여 뇌 반구를 이등분합니다. 두 반구를 분리합니다. 한쪽 반구를 나머지 반구가 들어 있는 냉각 슬라이스 용액에 다시 넣습니다.

면도날을 사용하여 소뇌를 제거합니다. 한쪽 반구를 정중선 쪽으로 눕히고, 날을 주둥이 쪽으로 약간 기울여 등쪽 표면에서 약 1mm 깊이로 절개합니다. 뇌를 뒤집어 놓습니다.

면봉과 금속 스패튤라를 사용하여 최근에 절단된 표면을 처리합니다. 뇌를 금속 절단 블록으로 옮깁니다. 면봉으로 뇌를 부드럽게 밀어 스패튤라에서 접착된 표면 위로 옮깁니다.

뇌 조직을 300 µm 두께의 절편으로 절단합니다. 어린 조직의 경우 절단 속도와 블레이드 주파수를 일반적으로 성숙한 조직에 사용할 때보다 느리게 설정합니다. 절단 후, 유리 피펫을 사용하여 각 절편을 실온의 산소화된 A-TSF가 들어 있는 유지 챔버로 옮깁니다. A-TSF는 A-CSF 용액보다 마그네슘 대 칼슘의 비율이 더 높습니다.

기록에 사용될 슬라이스는 회복을 위해 1시간 동안 방치합니다. 칼슘 의존성 지시약 또는 세포 특이적 마커를 세포에 로딩하려면 슬라이스를 염색 절차를 위한 챔버로 옮겨야 합니다. 상용 챔버가 판매되고 있지만, 표준 실험실 장비를 사용하여 매우 적은 비용으로 쉽게 조립할 수 있습니다.

염색 챔버를 제작하려면 다음과 같은 기본 실험 장비가 필요합니다: 플라스틱 페트리 접시 2개, 10 milliliter 주사기 1개, 실리카 튜브 일부, 반투과성 막이 있는 세포 배양 인서트, 순간접착제, 소형 튜브 커넥터 3개, 그리고 미세 镗 needle입니다. 큰 페트리 접시의 측벽에 가열된 막대를 사용하여 작은 구멍을 뚫습니다. 작은 페트리 접시에는 실리콘 튜브가 통과할 수 있을 만큼 유사한 직경의 구멍을 뚫습니다.

실리콘 튜브의 일부를 구멍으로 통과시켜 작은 디쉬 내부에 루프를 형성합니다. 순간접착제를 사용하여 튜브의 열린 끝부분을 밀봉합니다. 그런 다음 남은 튜브 부분을 작은 페트리 디쉬의 내벽에 부착합니다.

작은 페트리 접시를 큰 페트리 접시의 중앙에 놓고 접착제로 고정합니다. 실리콘 튜브의 남은 끝부분을 페트리 접시 측벽에 있는 작은 구멍을 통해 통과시킵니다. 가는 바늘을 사용하여 페트리 접시 내부에 있는 실리콘 튜브에 작은 구멍들을 만듭니다.

균일한 가스퍼 융합(gasper fusion)을 위해 일정한 간격으로 구멍을 뚫습니다. 가열된 메스를 사용하여 반투과성 막이 있는 세포 배양 웰을 준비합니다. 웰의 상단 1cm를 잘라내어 배양 동안 절편을 담을 수 있는 얕은 접시 형태로 만듭니다.

다공성 실리콘 튜브로 둘러싸인 작은 접시의 중앙에 얕은 접시를 배치합니다. 큰 접시의 뚜껑에 지름 약 0.5~1 cm의 구멍을 뚫습니다. 가열된 메스로 10 mL 플라스틱 주사기를 준비합니다.

주사기 끝부분을 비스듬하게 절단하여 제거합니다. 절단된 주사기 튜브 표면에 순간접착제를 바릅니다. 이를 대형 페트리 접시 뚜껑의 구멍 위에 직접 부착합니다.

시린지 팁 끝에 튜브 커넥터를 부착합니다. 다공성 가스 튜브가 접시 주위에 놓이도록 하여 얕은 접시를 작은 페트리 접시 중앙에 배치합니다. 그런 다음 이 튜브를 카보젠 가스 공급 장치에 연결하여 슬라이스에 산소를 공급합니다.

배양 동안, 주사기 팁을 통해 가스 공급 장치에 직접 연결된 대형 디쉬의 뚜껑을 닫습니다. 이렇게 하면 배양 중에 슬라이스 위로 탄산가스와 가스가 공급되어 염료의 탈색을 방지할 수 있습니다. 모든 과정은 가능한 한 빛 노출을 최소화하여 수행하며, 염료와 슬라이스 모두 암소 보관합니다.

슬라이스 홀더에서 A TSF 약 1.5 mL를 취해 염색 챔버를 채웁니다. 인터페이스 챔버를 내부에 배치하고 A TSF 1 mL를 추가로 채웁니다. 조직의 건강 상태를 유지하고 슬라이스가 적절히 로딩되도록 하기 위해 충분한 산소를 공급하는 것이 중요합니다.

염색 챔버가 가열되는 동안 뉴런으로의 염료 흡수를 용이하게 하기 위해 약 35 °C에서 염색을 진행합니다. fira 2:00 AM Ester용 지시 염료를 준비합니다. 50 µg 바이알에 1 µL의 onic acid와 9 µL의 DMSO를 첨가합니다.

DMSO와 oleic acid는 염료가 지질 막을 통해 흡수될 수 있도록 돕는 투과 촉진제로 작용합니다. 염료가 완전히 용해되도록 바이알을 15분 동안 볼텍싱하십시오.

염색을 위해 각 절편을 인터페이스로 옮깁니다. 염색 챔버에 삽입합니다. 절편 위의 관심 영역에 염료를 직접 떨어뜨린 후, 염색 챔버의 뚜껑을 닫습니다.

사용된 마우스의 연령에 따라 슬라이스를 20분에서 40분 동안 암소에서 배양하십시오. 배양 후, 슬라이스를 다시 슬라이스 홀더로 옮겨 남아 있는 과잉 염료를 씻어냅니다. 칼슘 이미징을 위한 염색 프로토콜은 더 오래된 조직에 맞게 조정하여 사용할 수도 있습니다.

이 과정에는 추가적인 사전 배양 단계가 필요합니다. 기존의 절편을 3 mL의 CSF와 0.5% 농도의 crema four 용액 8 µL가 채워진 얕은 사전 배양 접시로 옮깁니다. 35 °C에서 3분 동안 가열합니다. 그 후 절편을 인터페이스로 옮겨 염색 챔버에 삽입하고, 일반적인 염색 절차를 따릅니다.

이러한 절편들을 비신경 세포, 즉 성상교세포, 미세아교세포 및 내피세포에 대해 염색하는 것도 가능합니다. 성상교세포의 설포네이션(sulfonation)을 염색하기 위해 Sulfur rumine 1 0 1을 사용할 수 있습니다. 10 µM 용액을 만들어 절편 내의 관심 영역에 보라색 염료를 피펫으로 분주하십시오.

15분 동안 배양합니다. 슬라이스를 보관 챔버로 다시 옮겨 과량의 염색약을 제거합니다. 토마토 렉틴의 FSE 컨쥬게이트는 미세아교세포와 혈관내피세포를 염색할 수 있습니다.

토마토 렉틴의 경우, 20 µg/mL 농도의 용액을 제조합니다. 절편의 관심 영역에 염색약을 도포합니다. 절편을 45분 동안 배양합니다.

그런 다음 절편들을 다시 한번 보관 챔버로 옮깁니다. 이미징하는 동안 절편들은 현미경 아래에서 안정적으로 고정되어야 합니다. 일반적으로 조직을 고정하기 위해 금속 하프(metal harp)를 배치하지만, 이는 절편의 표면을 불균일하게 왜곡시켜 이미징 시 초점이 맞는 시야를 제한할 수 있으므로 주의해야 합니다.

이 슬라이스들은 폴리에틸렌(POLYETHALINE) 또는 PEI 용액을 사용하여 기록 챔버에 부착시킵니다. PEI는 최소 1시간 동안 세포의 표면 부착력을 높이기 위해 사용되는 폴리머입니다. 슬라이스를 기록 챔버에 넣기 전, 챔버 바닥이 덮일 정도의 PEI 용액 몇 밀리리터를 챔버에 채웁니다.

먼저, 증류수로 챔버 내의 PEI를 씻어낸 후, CSF 용액으로 치환합니다. 슬라이스를 기록 챔버로 옮기고 과잉의 A CSF 용액을 제거합니다. 가는 붓을 사용하여 슬라이스를 챔버 중앙에 위치시킵니다.

흡수성 여과지 조각을 사용하여 남은 A CSF를 모두 제거합니다. 슬라이스 가장자리에 A CSF가 더 이상 남아 있지 않도록 주의하십시오. 마지막으로, 슬라이스가 챔버에서 떨어지지 않도록 주의하며 0.5 mL의 A CSF를 슬라이스 위에 부드럽게 흡수시킵니다.

챔버를 산소가 공급되는 커다란 인터페이스 용기에 넣고 어두운 곳에서 1시간 더 둡니다. 칼슘 민감성 지시 염료의 변화는 1광자 또는 2광자 현미경으로 기록할 수 있습니다. 본 연구에서는 신경망의 2광자 이미징을 위해 Olympus 현미경에 연결된 티타늄 사파이어 레이저를 사용합니다.

또한, 프레임 스캐닝 속도를 높이기 위해 EM CCD hammer MATSU 카메라가 장착된 L Vision biotech trim scope 시스템을 사용합니다. 1.6 millimolar calcium과 1.5 millimolar magnesium이 포함된 산소화된 A-T-S-F-A-T-S-F가 안정적으로 흐르는 상태에서 슬라이스 챔버를 현미경 아래에 배치합니다. 설정 시 백색광을 사용하여 온도를 약 30 °C로 가열합니다.

슬라이스에서 관심 영역을 찾고 표면에 초점을 맞춥니다. 조명을 끄고 기록 캐비닛 문을 닫습니다. 이는 배경광 수준을 낮추기 위함입니다.

이미지를 기록하고 분석하는 데 사용할 수 있는 다양한 상용 또는 오픈 소프트웨어 패키지가 있습니다. 본 실험실에서는 Lavis Biotech의 inspector 소프트웨어를 사용하여 이미지를 획득합니다. 이미징을 시작하려면 검출을 위한 CCD 카메라 모드를 선택하십시오. 사용하는 지표에 맞는 파장을 설정하십시오.

fira 2:00 AM Ester의 경우, trim scope 소프트웨어에서 들뜸 파장을 820 nanometers로 설정합니다. 64 B 스캐닝 모드를 선택하십시오. 관심 영역에 최적화된 시야각(field of view) 크기와 픽셀 해상도를 선택하십시오.

이미지 샘플링에 필요한 적절한 프레임 속도와 픽셀 스피닝을 선택하십시오. 연속 이미징을 위해 레이저 셔터를 엽니다. 연속 이미징 모드를 사용합니다.

게인과 레이저 강도를 조절하고 이미징하려는 신경망에 초점을 맞춥니다. 스캔을 중단합니다. 프레임 속도와 시퀀스 지속 시간을 위한 타임랩스 설정을 선택합니다.

타임랩스 이미징 후, 위아래로 20 µm씩 1 µm 단계로 Z 스택 이미지를 생성하십시오. 이 Z 스택은 분석 과정 중 세포 검출에 사용됩니다. 기록된 파일들을 TIFF 이미지 스택으로 내보내십시오.

결론적으로, 본 영상에서는 발달 중인 피질 내의 동기화된 자발적 네트워크 활동을 측정하기 위해 칼슘 지시자를 사용하는 방법을 보여드렸습니다. 귀하의 실험실에서 이 기술을 구현하실 수 있도록 방법론 및 시약에 관한 더 자세한 내용은 본 영상에 첨부된 데이터 시트에서 확인하실 수 있습니다.