을 통해 대사 경로 확인 및 검색 ^{13 C - 라벨링}

본 프로토콜의 목적은 탄소 13 보조 대사 분석을 통해 박테리아의 대사를 연구하는 것입니다. 우선, 표지된 탄소 기질이 존재하는 환경에서 미생물을 배양하며, 이 기질은 미생물의 단백질에 통합됩니다. 이후 미생물을 수확하여 아미노산을 추출하고, 가수분해 및 유도체화 과정을 거칩니다.

시료를 가스 크로마토그래피 질량 분석기(GCMS)에 적용합니다. 생화학 네트워크 내 대사산물 간의 원자 전이 경로를 추적함으로써, 미생물이 이용하는 기능적 대사 경로를 결정할 수 있습니다. 저는 Bert Burla입니다.

여기에서 제시하는 방법은 미생물의 대사 경로를 결정하기 위해 전사체학 및 단백질체학을 보완하는 수단으로 사용될 수 있습니다. 우리는 이 기술을 사용하여 시아노박테리아와 같은 광합성 미생물의 마이오트로픽(myotrophic) 또는 종속영양 탄소 이용 능력을 조사해 왔습니다. 본 영상에서는 표지된 탄소 기질을 사용하여 새로운 효소 기능을 발견하는 과정을 시연하기 위해 ANOTHE 5 1 1 42를 모델 균주로 사용할 것입니다.

본 절차의 시연은 저와 li Yu, 그리고 Chu Yang Fang이 진행하겠습니다. 먼저 표시되지 않은 배지에서 cyana thesei 박테리아를 배양하여 이 절차를 시작하십시오. 박테리아가 대수 성장기의 중간 단계에 도달하면, 탄소 13 표지 배지에 부피 대비 3%를 접종하십시오.

그 다음, 초기 접종 배양액으로부터 표시되지 않은 탄소가 대수 성장기 중간 단계의 동일한 표시 배지로 유입되는 것을 방지해야 합니다. 13C로 표시된 Cy Thesei 박테리아가 대수 성장기 중간 단계에 도달하면, 원심분리를 통해 10 milliliters를 수확합니다. 침전물을 1.5 milliliters의 6 M 염산에 재현탁하여 투명한 유리 스크류 캡 가스 크로마토그래피 또는 GC 바이알로 옮깁니다.

바이알의 캡을 닫고 100 °C 오븐에 24시간 동안 넣어 바이오매스 단백질을 아미노산으로 가수분해합니다. 바이오매스 펠렛의 가수분해를 통해 20가지 일반 아미노산 중 16가지가 생성됩니다. 가수분해 후, 아미노산 용액을 2 mL 마이크로 원심분리 튜브로 옮긴 다음 20,000 Gs에서 5분 동안 원심분리합니다. 가수분해 후, 고체 입자를 침전시키기 위해 아미노산 용액을 2 mL 마이크로 원심분리 튜브로 옮긴 후 20,000 GS에서 5분 동안 원심분리합니다.

원심 분리 후, 가수분해 용액 내의 고체 입자가 GC 컬럼으로 유입되지 않도록 상층액을 새로운 GC 바이알로 옮깁니다. 다음으로, 가스 크로마토그래피 분리가 가능하도록 아미노산을 휘발성 형태로 유도하기 위해 건조합니다. 건조된 시료를 150 µL의 테트라하이드로퓨란(THF)과 150 µL의 N-메틸-N-(트라이메틸실릴)트라이플루오로아세트아마이드(MSTFA)에 녹입니다.

Acetamide, T-B-D-M-S 유도체화 시약을 넣고 모든 시료를 65~80°C 오븐에서 1시간 동안 배양합니다. 바이알 내의 대사물이 완전히 용해되도록 가끔씩 볼텍싱합니다. 시료를 20,000 ×g에서 10분 동안 원심분리한 후, 상층액을 새 GC 바이알로 옮깁니다.

상층액은 투명한 노란색 용액이어야 합니다. GC 온도는 다음과 같이 설정합니다. 150 °C에서 2분 동안 유지합니다. 이후 분당 3 °C씩 280 °C까지 승온합니다.

분당 20 °C의 속도로 300 °C까지 온도를 높인 후 5분 동안 유지합니다. 그런 다음 30 m GC 컬럼의 경우, 용매 지연 시간(solvent delay)을 약 5분으로 설정하고 질량 대 전하비(mass to charge ratio) 범위를 60에서 500 사이로 설정합니다. 분석 조건은 분석법에 따라 분할비(split ratio) 1:5 또는 1:10, 주입 부피 1 µL, 운반 가스로 1.2 mL/min의 헬륨을 사용하여 GC-MS로 시료를 분석합니다.

Microsoft Excel을 사용하여 GCMS 데이터를 분석합니다. 각 아미노산의 GC 머무름 시간과 고유한 질량 대 전하비 피크가 이 그림에 예시되어 있습니다.T-B-D-M-S. 유도체화된 아미노산은 일반적으로 MS에 의해 두 개의 전하 파편으로 명확하게 분리되는데, 이는 아미노산 전체를 포함하는 M minus 57 파편과 류신 및 이소류신의 아미노산 알파 카복실기가 결여된 M minus 1 59 파편입니다.

M-57 피크는 다른 질량 피크 파편과 겹쳐 있었습니다. N-15는 전체 아미노산 표지를 분석하는 데 사용할 수 있습니다. 또한, F 3 0 2 그룹은 대부분의 아미노산에서 자주 검출되며, 이는 아미노산 골격의 첫 번째 알파 카복실기(alpha carboxyl group)와 두 번째 탄소만을 포함합니다.

하지만 이러한 Ms.Peak는 신호 대 잡음비가 높은 경우가 많으므로, F 3 0 2를 정량적인 대사 플럭스 분석에 사용하는 것은 권장되지 않습니다. 아미노산이나 중심 대사산물의 유도체화 과정에서 carbon 13, oxygen 18, silicon 29 및 silicon 30을 포함하여 천연적으로 표지된 다량의 동위원소가 유입됩니다. 가공되지 않은 질량 동위원소 또는 스펙트럼 내 천연 동위원소로 인한 측정 노이즈는 공개된 소프트웨어를 사용하여 보정할 수 있습니다.

최종 동위원소 표지 데이터는 질량 분율로 보고됩니다. 예를 들어, M0, M1, M2, M3 및 M4는 0개에서 4개의 $^{13}\text{C}$ 표지 탄소를 포함하는 조각을 나타냅니다. 이 5 1 1 2에는 일반적인 isle 합성 경로에서 three anine을 two keto butyrate로 전환시키는 효소인 three anine ammonia lyase가 포함되어 있지 않습니다.

따라서 이 생물체에서 isle 경로를 규명하기 위해, cyana THESEI 5 1 1 42를 54 millimolar 글리세롤이 포함된 ASP two 배지에서 배양하고 여기에 제시된 비디오의 설명대로 GCMS를 통해 분석하였습니다. Cyana Thesei 5 1 1 4 2는 2번 위치가 표지된 글리세롤을 주요 탄소원으로 사용하며, 전구체가 pyruvate인 thianine과 alanine은 하나의 표지된 탄소를 가지는 반면 ISO leucine은 세 개의 탄소가 표지되었음을 관찰하였습니다. 그러므로 cyana these 5 1 1 4 2의 synthesis는 대부분의 생물체가 사용하는 thianine 경로에서 유도될 수 없습니다. 반면, leucine과 ISO leucine은 fragment M minus 15 및 fragment M minus 1 59를 기반으로 동일한 표지 패턴을 보입니다.

예를 들어, 분절되지 않은 아미노산을 포함하는 $^{15}\text{N}$ 동위원소 또는 데이터에서 류신(leucine)과 이소류신(isoleucine)의 표지가 동일하게 나타났습니다. 따라서 류신과 이소류신은 동일한 전구체인 피루브산(pyruvate)과 아세틸-CoA(acetyl-CoA)로부터 합성되어야 합니다. 이러한 관찰 결과는 이소류신 합성을 위한 시트르산-말산 경로(citramalate pathway)의 표지 탄소 전이와 일치합니다.

이 방법은 매우 다양한 미생물의 대사를 연구하는 데 사용할 수 있으며, 숙달되면 시작부터 종료까지 약 일주일 만에 수행할 수 있습니다.