다중 타겟 추적 (MTT)에 의해 플라즈마 막의 분자 확산을 매핑

안녕하세요. 본 영상에서는 전체 단일 양자 추적 실험을 선보입니다. 전용 알고리즘은 이미지 ISIS 전문가들과의 협업을 통해 전면적으로 설계되었습니다. 이 영상에서는 상피세포 성장인자 수용체를 모델로 사용하여 이 기술의 분석 방법을 설명하겠습니다.

상피세포 성장인자 수용체(epidermal growth factor receptor)는 transmembrane 단백질입니다. 이 수용체는 단클론 항체를 사용하여 표지하며, 이때 항체는 A a B 단편만 남도록 환원시킵니다. A a B 단편은 비오틴화(biotinylated)되며, 이후 퀀텀닷의 스트렙타비딘(streptavidin)과 결합하여 전체 시스템이 EGF 수용체를 정밀하게 인식하게 됩니다.

우리의 목표는 세포 표면 수용체의 역동성에 대한 종합적인 관점을 제공하는 것입니다. 실제로 분자 궤적은 나노 도메인 내에 갇힘으로써 브라운 확산으로부터 벗어날 수 있습니다. 예를 들어, 이는 신호 전달 파트너나 분자 스캐폴드와 같은 요소와의 잠재적인 상호작용의 징후일 수 있습니다.

우리는 높은 SPECT 시간 분해능과 높은 표지 밀도를 동시에 확보하여 세포 전체에 걸쳐 이러한 이벤트들을 매핑함으로써 이를 포괄적으로 기술하는 것을 목표로 합니다. 따라서 우리는 이 접근법을 다중 표적 추적(multi target tracing)이라고 명명합니다. 실험의 첫 번째 단계는 시료 준비입니다.

항생제가 포함되지 않은 배지에서 살아있는 세포를 이용하여 실험을 수행합니다. 본 실험에서는 EGF 수용체를 내인성으로 발현하는 Cos-7 세포를 사용합니다. 세포를 분리한 후, 실험실의 각 웰에 동일한 수의 세포가 들어가도록 정확하게 농도를 확인해야 합니다.

세포 수를 정확히 맞추는 것은 세포당 양자점 수의 예측 가능성을 높이는 데 매우 중요합니다. 세포를 H-well에 분주한 후, 37°C, 7% CO2 조건에서 24시간 동안 배양해야 합니다. 다음 단계는 항체가 결합된 양자점을 준비하는 것입니다. 양자점은 작은 형광 나노입자입니다.

이러한 입자들은 기존의 형광 프로브 및 신호와 비교하여 매우 밝고 안정적이기 때문에 여기서 매우 큰 관심 대상입니다. 이 유형의 실험에서는 노이즈 비율이 매우 중요합니다. 이 경우, 양자점 주변의 스트립 면을 포화시켜 응집을 방지하기 위해 완전 배지를 사용합니다.

그 후, 통계적으로 더 많은 일가(monovalent) 양자점을 얻기 위해, 바이오틴화된 관심 단백질 또는 항체와 양자점을 1:1 비율로 혼합하였습니다. 본 실험에서는 단일클론 항체로부터 연구실에서 직접 제작하고 바이오틴으로 표지한 EGF 수용체에 대한 Fab 단편을 사용합니다. 약 15분간의 배양 동안, 분당 1,200회 회전 속도와 25°C 조건의 쉐이커를 사용하여 응집을 방지하고 균질성을 유지하며 제어할 수 있습니다.

혼합물이 준비되면 세포에 첨가할 수 있습니다. 랩테크(lab tech) 상에서 세포가 탈락하는 것을 방지하기 위해 웰(well)에서 배지를 매우 조심스럽게 제거하고, 실험에 필요한 양의 혼합물을 첨가합니다. 본 사례에서는 웰당 100 µL의 혼합물을 첨가합니다.

혼합물을 첨가한 후, 세포를 15분 동안 배양하십시오. 이때 37°C, 7% CO2 조건에서 배양합니다. 배양이 끝나면 배지 상에 부유하는 빈번한 쌍점(twin dots)이 많이 관찰될 수 있습니다.

이 양자점들은 이미징 전에 제거해야 합니다. 우리가 유발하는 노이즈 때문입니다. 그렇기 때문에 각 웰을 여러 번, 이 경우에는 다섯 번 세척하여 양자점들을 씻어내야 합니다.

자가형광이 없는 이미징 배지를 사용하십시오. 여기서는 aps가 포함된 HBSS 버퍼를 사용합니다. 이제 세포 준비가 완료되었습니다.

이제 데이터 수집을 위한 장치로 이동하겠습니다. 이 장치는 도립 현미경, 고감도 카메라, 강력한 수은 램프, 그리고 세포를 37°C로 유지하기 위한 배양기라는 네 가지 주요 부분으로 구성되어 있습니다. 수은 램프에서 나온 빛은 광섬유와 필터 휠을 통과한 후 시료를 조사합니다.

시료의 형광 신호는 필터링되어 왼쪽에 있는 E-M-C-C-D 카메라로 수집됩니다. 현재 저희는 개구수 1.3 및 1.49의 오일 침강 대물렌즈를 사용하고 있습니다. 이 실험의 핵심 단계는 영상 획득 그 자체입니다.

세포의 초점이 맞으면, 라벨링이 강하게 된 대표적인 세포를 관찰합니다. 퀀텀 닷의 경우, 먼저 투과 백색광으로 단일 이미지를 획득하며, 이는 세포의 외형과 LA podia의 특수한 경계를 확인하는 데 사용할 수 있습니다. 그런 다음 일반적으로 36 millisecond 속도로 비디오를 획득하는데, 이는 전체 프레임에서 허용되는 가장 빠른 속도입니다.

우리는 최소 20dB 이상의 충분한 신호 대 잡음비를 가진 단분자 민감도를 달성하기 위해 전자 증배 CCD를 사용합니다. 일반적으로 약 25dB 정도이며, 보통 300프레임을 획득합니다. 특정 데이터셋을 평가하려면 비디오 파일이 포함된 디렉토리 경로만 제공하면 됩니다.

그런 다음 명령어를 입력하면, MetLab에서 텍스트가 다시 연결되거나 또는 모든 사용 파라미터가 나열된 그래픽 인터페이스를 먼저 표시하는 MTT 23 I 명령어를 통해 완전 자동화된 분석이 시작됩니다. 핵심 MTT 분석은 각 프레임에 대해 수행되며, 세 가지 주요 작업 중 첫 번째로 각 픽셀에서 타겟 양자 점의 존재 여부를 감지하는 검출 과정을 호출합니다.

그런 다음 각 검출 단계에서 픽셀 위치, 신호 강도 등 표적과 관련된 매개변수를 추정합니다. 마지막으로, 모든 픽셀에 대해 이전 프레임들에서 이미 구축된 궤적들을 사용하여 새로운 표적들을 재연결합니다.

국소 하위 영역을 고려하여, 노이즈만 존재하거나 신호가 존재한다는 두 가지 가설을 비교합니다. 점 확산 함수(point spread function)를 통해 ModuLite는 좁은 피크를 가집니다. 우리는 감지된 타겟당 프레임당 1회 미만의 오검출이 발생하도록 하여 충분히 낮은 허위 경보를 보장하는 임계값을 사용합니다.

다음으로, 검출된 Gaussian의 위치, 너비 및 높이를 추정하기 위해 최소제곱 Gaussian 피팅을 수행합니다. 이를 통해 염료의 정밀한 세포 위치를 얻을 수 있으며, 일반적인 신호 대 잡음비에서 통상적으로 10~20 nm 정도의 정확도를 보입니다. 고밀도 피크의 경우 서로 너무 가깝게 위치할 수 있으며, 강한 피크가 약한 피크의 검출을 방해할 수 있습니다. 이를 처리하기 위해, 초기 이미지에서 검출된 피크를 디플레이션(deflate)합니다.

마찬가지로, 잔차(residual)에 대한 검출은 일반적으로 피크의 10%를 다시 왜곡시킬 수 있습니다. 거의 모든 피크를 검출하는 것은 정확한 재연결을 위해 매우 유용합니다. 이후 새로운 타겟 집합을 해당 동공(pupil)의 이전 추적 집합과 매칭합니다.

가능한 경우 각 트레이스를 타겟에 할당하고 발생 가능한 블링킹(blinking)을 처리하기 위해, 검출 단계에서 얻은 모든 가용 통계 정보를 사용합니다. 따라서 타겟을 단순히 가장 가까운 트레이스에 할당하지 않습니다. 트레이스가 교차하여 각각의 관련 탐색 영역이 겹치는 충돌이 발생하는 경우, 트레이스와 타겟 모두에 대해 강도, 속도, 너비 및 블링킹의 통계 값을 고려합니다.

이를 통해 통계적으로 최적의 재연결 점수를 얻을 수 있습니다. 이 전략을 통해 가능한 경우 재연결이 가장 가까운 이웃, 즉 가장 느린 움직임으로 편향되는 것을 방지할 수 있습니다. 다음으로, 궤적 내에서 발생할 수 있는 일시적인 구속(transient confinement)을 평가하기 위해 함수를 사용합니다.

이 기능은 Sexton Simpson과 공동 연구진에 의해 확립된 바와 같이 국소 확산과 반비례 관계에 있습니다. 임계값을 적용함으로써 구속 여부가 결정된 에피소드를 정의할 수 있습니다. 모든 궤적에 대해 이를 반복함으로써, 결과적으로 일시적 구속 및 속도 저하 증거의 관점에서 막 역학을 매핑할 수 있으며, 이를 시각화하여 나타낼 수 있습니다.

대신에, 이 구속 지수의 이진 또는 이산 값을 사용하면, 기본적으로 MTT가 이러한 작업들을 자동으로 수행하며, 각 비디오에 대해 각 피크의 행 파라미터를 eski 파일에 저장하여 향후 심층 조사를 가능하게 합니다. 각 세포 위의 궤적 맵이나 관심 파라미터, 피크 강도, 신호 대 잡음비, 국소 결핍 값 등의 히스토그램 플롯과 같은 전형적인 결과들이 도출되며, 따라서 이 기능은 어떠한 전용 조사에도 쉽게 맞게 조정될 수 있습니다. 이제 이 비디오에서는 MTT를 통해 얻은 전형적인 결과들을 요약하겠습니다.

작업의 상당 부분은 알고리즘을 정교화하는 데 있으며, 이는 운동의 고통 모드(suffering modes of motion)나 상호작용과 같은 특정 조사 목적에 맞게 조정되어야 할 수 있습니다. 하지만 MTT를 실행하는 방법은 매우 간단합니다. 사용자는 공간 및 시간 제한과 같은 몇 가지 매개변수만 최적화하면 됩니다.

MTT를 정교화하면서, 우리는 각 작업에 사용되는 분석적 옵션들을 전면적으로 재검토하고자 했습니다. 우리는 두 가지 도전적인 축을 따라 프로세스를 최적화했습니다. 첫째는 표면 전체에 걸쳐 최상의 공간 정보를 얻기 위해 고밀도를 처리하는 것이며, 둘째는 일반적으로 낮은 소멸률과 고속 구속 하에서 작업할 수 있게 하는 낮은 SNR을 처리하는 것입니다. 이는 잠재적인 상호작용의 징후로 해석될 수 있습니다.

막 수용체는 예를 들어 막 하부 세포골격이나 단백질 지질 도메인과 상호작용할 수 있습니다. 이러한 현상은 공간 및 시간적 구속(confinement)의 변화를 통해 조사할 수 있습니다. 동역학적 측정값은 FRAP, FCS 또는 FRET과 같은 상호 보완적인 방법들과 비교될 수 있습니다.

오픈 소스 코드는 학술 연구용으로 제공됩니다. 저희 팀 페이지의 S fr에 있는 CML dot univ 웹페이지에서 다운로드 링크를 통해 내려받으실 수 있습니다. 관심 있는 기업 관계자분들의 연락도 환영합니다.

지원과 유익한 토론을 제공해 주신 저희 팀원들과 공동 시설 관계자분들께 특별히 감사드립니다. 본 프로젝트는 CNRS, MAA University Pac Region National de La, 그리고 Foundation Medical의 자금 지원을 받았으며, 리그 컨트롤러(league controller)의 지원을 받았습니다. 시청해 주셔서 감사합니다.