라이신 Demethylase 활동의 양적 측정을위한 MassSQUIRM의 응용

Mass squirm 프로토콜은 동위원소 메틸화 및 MALDI 질량 분석법을 사용하여 라이신 탈메틸화 효소(lysine demethylase)의 활성을 정량화하는 것을 목표로 합니다. 먼저, 메틸화된 라이신을 포함하는 펩타이드에서 효소 촉매 탈메틸화 반응을 수행합니다. 그 후, 탈메틸화 효소 반응으로 생성된 펩타이드 생성물을 중수소화 포름알데히드로 화학적으로 메틸화하여 MALDI에서 동일한 방식으로 이온화되는 균일하게 메틸화된 펩타이드를 생성합니다. 이어서 MALDI 질량 분석법으로 각 펩타이드 종을 정량화하고 동위원소 중첩을 고려합니다. 비메틸화, 단일 메틸화, 이중 메틸화 및 삼중 메틸화된 펩타이드의 상대적 양을 식별하기 위해, mass squirm 결과는 질량 변화를 기반으로 각 탈메틸화 반응 생성물의 상대적 양을 결정합니다.

통상적인 몰드 질량 분석법과 같은 기존 방법보다 이 기술이 갖는 주요 장점은 질량 점수가 서로 다르게 메틸화된 펩타이드 간의 이온화 차이를 반영한다는 점입니다. 저희는 동위원소가 표지된 무거운 무수 초산을 사용하여 히스톤 아세틸화 수준을 측정하는 방법을 개발했을 때 처음으로 이 접근 방식에 대한 아이디어를 얻었습니다. 이 기술의 어려운 점은 피크 면적 데이터를 추출하는 것이며, 이는 펩타이드 동위원소 포락선의 중첩으로 인해 복잡해질 수 있습니다.

탈메틸화 반응을 위해 125 nanograms의 재조합 lysine specific demethylase one 효소와 0.25 micrograms의 biotinylated dimethyl hisone H three 펩타이드를 최종 부피 20 microliters의 demethylase 버퍼에 혼합합니다. 또한 LSD one 효소가 없는 0.25 micrograms의 펩타이드를 포함하는 대조군 샘플을 준비합니다. 반응 튜브와 대조군 튜브를 37 degrees Celsius에서 2시간 동안 배양합니다. 다음으로 R two 20 micron 다공성 비드를 준비하기 위해 비드와 메탄올을 동일한 부피로 혼합합니다.

그 다음 TFA 포름산 10배 부피를 첨가하고, 각 샘플에 다공성 비드 8 µL를 넣은 후 상온에서 15분 동안 교반합니다. 그동안 두 개의 C 18 zip tip을 컨디셔닝합니다. 0.1% TFA 20 µL로 두 번 피펫팅하고, 70% 아세토니트릴 0.1% TFA로 네 번, 다시 0.1% TFA로 네 번 피펫팅합니다.

다음으로, 컨디셔닝된 zip tip에 두 샘플을 로딩합니다. 피펫을 사용하여 C 18 수지를 통해 용액을 밀어 넣습니다. 두 샘플의 전체 부피가 zip tip을 모두 통과할 때까지 이 과정을 반복합니다.

그런 다음 0.1% TFA 20 µL로 zip tip을 두 번 세척하고, 40 µL의 용출 버퍼(elution buffer)로 샘플을 용출한 후 speed vac 농축기로 완전히 건조합니다. 먼저 샘플을 50 mM 인산 완충액(pH 7.4) 100 µL에 재현탁합니다. 그다음 borane dimethyl amine 8 µL와 derated formaldehyde 16 µL를 첨가합니다.

4°C에서 2시간 동안 배양합니다. 보론 디메틸아민과 중수소화 포름알데하이드를 첨가하여 환원적 메틸화를 반복하고 2시간 동안 배양합니다. 세 번째로, 보론 디메틸아민을 첨가하고 4°C에서 15시간 동안 배양합니다.

1M Tris (pH 7.4) 12.5 µL를 가하여 반응을 정지시킨 후, SpeedVac 농축기로 완전히 건조시킵니다. 대조군 및 탈메틸화 효소 반응 샘플을 50 mM 인산염 완충액 (pH 7.4) 100 µL에 재현탁합니다.

이제 대조군과 탈메틸화 효소 반응 샘플에 8 µL의 다공성 비드를 추가하고, 앞서 설명한 대로 집 팁(zip tip)으로 수집합니다. 2 µL씩 MALDI 샘플 플레이트에 용리시킨 후, 실온에서 결정화될 때까지 건조합니다. 질량 분석법을 통해 샘플 분석을 진행하십시오.

spectro 파일을 작업 소프트웨어에서 열고 M over Z 소프트웨어로 내보냅니다. 탠덤 질량 분석법을 통해 반응 생성물을 추가로 검증합니다. 먼저, 대조군 샘플에 대해 단일 동위원소 피크 대비 carbon 13 C two 및 carbon 13 C four 동위원소의 피크 면적 비율을 결정합니다.

이 계산된 비율을 사용하여 각 변형에 존재하는 펩타이드의 상대적 양을 정량화하십시오. 탈메틸화 반응 샘플의 상태입니다. LSD 단일 효소는 라이신 탈메틸화의 질량 분석 정량화에 효과적으로 사용될 수 있습니다.

대조군 반응은 환원적 메틸화를 거치지 않으므로, 이는 해당 펩타이드의 전형적인 동위원소 포락선을 나타냅니다. 결과 피크 면적을 통해 carbon 13 C two 및 carbon 13 C four 형태로 존재하는 펩타이드의 배경 비율이 결정됩니다. 대조군 반응의 질량 분석 스펙트럼에서 얻은 동위원소 상태 및 피크 면적을 통해 각 수식 상태로 존재하는 펩타이드의 상대적 양을 정량화할 수 있습니다. 데메틸라아제 반응에서, 이러한 대조군 및 데메틸라아제 반응의 피크 면적을 통해 33.7%의 dimethyl lysine 4, 42.0.3%의 monomethyl lysine four, 그리고 24%의 unmethylated lysine four가 결정됩니다.

이러한 질량 분석 기반의 스크리닝(mass squam) 접근 방식은 히스톤 라이신 잔기의 탈메틸화가 다양한 질병에 어떻게 기여하는지와 같은 히스톤 후성유전학 분야에 핵심적인 통찰을 제공합니다. 이 메틸화 분석법은 탈메틸화 효소를 연구하는 데 적용되어 왔지만, 메틸전이효소를 연구하는 데에도 활용될 수 있습니다.