전체 마운트 근육 분석에 의한 재현성 마우스 좌골 신경 크러시와 중생의 후속 평가

본 절차의 전반적인 목적은 좌골 신경 손상(sciatic nerve crush)의 단순하고 재현 가능한 방법과 좌골 신경 손상 후 근육 재신경지배(reinnervation)의 전체 마운트 분석법을 시연하는 것입니다. 이를 위해 먼저 수술용 리트랙터를 적절히 배치하여 신경에 원활하게 접근할 수 있도록 좌골 신경을 노출시킵니다. 그다음, 지혈 겸자(hemostat forceps)로 신경을 압착하고 숯(charcoal)으로 신경에 표시합니다.

그 다음, 뒷다리에서 좌골 신경이 지배하는 개별 근육들을 제거합니다. 마지막 단계는 면역 염색 후 전체 마운트 분석을 위해 개별 근육을 박리하는 것입니다. 결과적으로, 재현 가능한 좌골 신경 압착술을 간단히 수행할 수 있으며, 근육 전체 마운트를 통해 이후의 재생 과정을 분석할 수 있음을 보여줍니다.

이 절차의 주요 장점은 좌골 신경을 압착하고 이후 축삭 재생 정도를 평가할 수 있는 단순하고 재현 가능한 기술을 제공한다는 것입니다. 수술 전, 술후 통증을 최소화하기 위해 케타민 100 mg/kg과 자일라진 10 mg/kg의 칵테일을 복강 내 주사하여 마우스를 마취함으로써 이 절차를 시작하십시오. 또한 마우스에게 멜록시캄 10 mg/kg을 피하 주사합니다.

다음으로, 수술용 클리퍼를 사용하여 양쪽 뒷다리를 조심스럽게 털을 깎습니다. 그런 다음 완전한 제모를 위해 제모 크림을 도포합니다. 멸균 면봉과 Betadine 수술용 세정액으로 피부를 깨끗이 닦아냅니다.

그 후, 멸균 면봉을 사용하여 안구에 안연고를 도포합니다. 마우스를 예열된 홈오테믹(homeo themic) 담요 위의 깨끗한 스테인리스 스틸 판 위에 놓아 동물의 체온을 37 °C로 유지합니다. 그런 다음 모든 사지를 테이프로 고정합니다.

무릎 관절이 몸체와 직각을 이루도록 뒷다리를 대칭적으로 조심스럽게 배치합니다. 그 후, 현미경 하에서 수술 부위를 멸균 드레이프로 덮습니다. 정중선을 따라 반원형으로 절개합니다.

피부를 하부 근육층으로부터 조심스럽게 분리하고, 수시로 피부를 접어 둡니다. 수술 부위를 촉촉하게 유지하기 위해 약 0.1 milliliters의 멸균 식염수를 도포합니다. 다음으로, 대둔근과 대퇴이두근 전두 사이의 근막면을 엽니다.

수술 대조군을 위해 좌골 신경을 노출시킵니다. 반대측 좌골 신경을 노출시키고 가동화하되, 손상되지 않은 상태로 유지해야 합니다. 그런 다음 둔근을 다시 배치하고 봉합합니다.

리트랙터를 사용하여 동일한 방식으로 실험용 좌골 신경을 노출시킵니다. 시각적 확인을 용이하게 하기 위해, 홍채 절제 가위를 사용하여 주변 결합 조직으로부터 좌골 신경을 조심스럽게 분리합니다.

그런 다음 미세 5 45 핀셋을 사용하여 신경을 초미세 지혈鉗子(hemostatic forceps)의 하단 턱에 배치하고, 세 개의 근막이 서로 겹치지 않게 나란히 정렬합니다. 지혈鉗子의 끝에서 1.5 mm 지점에 표시가 각인되어 있습니다. 압착하기 전, 좌골신경의 가장 바깥쪽 부분이 이 표시와 일직선이 되도록 배치하십시오.

이렇게 함으로써 균일한 너비로 압착이 이루어지게 하며, 압착력으로 인해 신경이 납작해졌을 때 지혈 겸자의 턱 바깥으로 신경이 밀려나지 않도록 합니다. 만약 신경이 겸자 팁 바깥으로 확장되면 신경의 일부만 압착됩니다. 미리 카본 분말에 담갔다 뺀 두 번째 지혈 겸자를 사용하여 압착 부위를 표시하십시오.

동일한 압착 부위를 세 번의 클릭으로 15초 동안 압착합니다. 탄소 표식이 초기 압착 경계를 벗어나지 않아야 합니다. 압착 부위의 정밀한 표식이 필요한 경우, 포셉을 탄소에 미리 담가 수술 부위에 탄소가 넓게 퍼지는 것을 방지하는 것이 특히 중요합니다.

분말 탄소 속에 포셉을 넣고 엽니다. 그런 다음 조심스럽게 닫습니다. 멸균 거즈를 사용하여 지혈鉗(hemostats) 외부에 묻은 탄소를 닦아냅니다.

포셉의 분쇄 표면에 탄소 가루가 고르게 코팅되었는지 확인하기 위해 최소 3배율 이상에서 확인합니다. 필요한 경우, 다시 담갔다가 닦아내고 반대측과 동일한 방식으로 둔근을 다시 배치하고 봉합합니다. 마지막으로 9mm 리플렉스 클립을 사용하여 피부 절개 부위를 폐쇄합니다.

9 mm 리플렉스 클립(reflex clips)이 움직임을 제한하는 것으로 판단되면, 더 작은 리플렉스 클립이나 6-0 자동 봉합사를 사용할 수 있습니다. 대신, 마우스를 희생시킨 후 네 가지 근육을 제거합니다. 뒷다리의 전경골근(tibialis anterior), 장지신근(extensor digitorum longus), 장비골근(peroneus longus) 및 가자미근(soleus)을 결합 조직을 통해 검은색 사드 코팅 접시에 핀으로 고정하여 조심스럽게 분리합니다.

그런 다음 PBS로 헹굽니다. 이어서 4% Paraform aldehyde로 30분 동안 고정합니다. 검은색 sard 코팅 페트리 접시 위에서 각 근육을 박리하기 위해, iridectomy scissors를 사용하여 힘줄을 제거합니다.

그 후, 내부 근섬유를 벗겨내어 근육을 얇게 만듭니다. 종판 밴드(endplate bands)를 포함한 근육의 외부 표면을 주의 깊게 보존하십시오. 그런 다음, 결과물을 vector shield와 22 by 40 millimeter 유리 커버슬립을 사용하여 플러스 슬라이드에 마운트하고, 양쪽 두 면을 투명 매니큐어로 밀봉합니다. 슬라이드에 적절히 마운트되었을 때, 종판 밴드가 커버슬립에 접촉되어 있어야 합니다.

왼쪽 뒷다리의 생체 내(in situ) 압착 부위 예시입니다. 압착 부위는 검은색 카본으로 표시되어 있습니다. 별표는 대퇴 근육에 분포하며 유용한 지표 역할을 하는 경골 신경의 분지를 나타냅니다.

분쇄 수술 중에 좌골 신경의 경골 분지는 파란색으로, 비골 분지는 녹색으로, 그리고 srel은 노란색으로 표시되어 있습니다. 이 반박절 절편은 지혈 겸자로 수행한 완전 분쇄 상태를 보여줍니다. 화살표 머리는 이곳의 분쇄된 섬유들을 가리킵니다.

각도가 있는 포셉을 사용하여 불완전하게 압착한 모습이 다른 반-가늘게 자른 단면(semi fin section)에서 확인됩니다. 화살표 머리는 압착된 섬유를 다시 나타내며, 화살표는 보존된 축삭을 나타냅니다. 이들은 전체 마운트 근육에서 렌더링된 이미지들입니다.

결합 조직을 제거하고 얇게 만든 후, 각 근육에서 신경종판(nplate) 밴드의 윤곽을 표시합니다. 여기에는 좌측(sous) 전체 마운트 근육이 나타나 있습니다. 좌골 신경 손상 후 14일이 경과한 상태입니다.

화살표는 축삭에 의해 재지배된 신경근 접합부의 영역을 나타냅니다. 여기는 탈신경된 신경근 접합부의 시연입니다. Gap 43 양성 슈반 세포 돌기는 화살표 머리로 표시되어 있습니다.

이 탈신경된 신경근 접합부에서는 축삭이 보이지 않습니다. 이 비디오를 시청한 후에는 정적인 신경을 재현 가능하게 압착하고 재생 분석을 위한 근육 호르몬 표본을 준비하는 방법에 대해 충분히 이해하게 될 것입니다.