다른 Lineages로 인간 배아 줄기 세포 (hESC)의 전파 및 차별 화를위한 3D 플랫폼으로서 알긴산의 Microcapsule

이 프로토콜은 다능성 인간 배아 줄기세포를 3D 시스템 내에서 캡슐화하여 도파민성 신경세포로 분화시키기 위해 최적화되었습니다. 먼저, 콜로니를 ROCK 억제제(RI)로 처리하고, 이를 알긴산나트륨과 혼합하여 단일 세포로 분리한 후 캡슐화 장치에 통과시킵니다. RI 처리를 3일 동안 지속한 다음, 캡슐화된 세포를 PA 6 세포로 옮겨 28일 동안 분화시킵니다.

최종적으로, 유전자 및 단백질 발현 분석 결과 도파민성 뉴런 생성 효율이 더 높게 나타났습니다. 기존의 2D 분화 프로토콜과 비교하여 이 특정 기술의 주요 장점은 세포를 3D 환경에서 증식 및 분화시킨다는 점이며, 이러한 3D 환경은 세포가 고밀도로 증식할 수 있는 기회를 제공합니다. 또한, 이는 분화를 위한 더 나은 세포 간 상호작용을 가능하게 합니다.

셋째로, 향후 분화 효율을 더 높일 수 있습니다. 또한, 이 특정 기술은 3D 환경에서 증식시킬 수 있는 다른 유형의 세포에도 적용 가능하다는 점을 덧붙이고 싶습니다. 아울러, 이 기술은 세포 사멸을 방지하고 세포가 배양 접시에서 떨어지는 것을 막아주는 특정 ROCK 억제제를 사용하여 최적화되었다는 점을 기억하시기 바랍니다.

일반적으로 이 방법이 생소한 연구자들은 이 기술이 조직 배양에서 흔히 수행되지 않기 때문에 초기에 어려움을 겪을 수 있습니다. 다음의 캡슐화 기술은 R 억제제 유형의 alginate 적용, alginate 농도 및 캡슐화 장치 설정에 관한 Dean 박사와 Chad 박사의 요약 연구를 바탕으로 최적화되었습니다. 이제 저희 연구실의 박사 과정 학생인 Jamie와 Kim이 이 프로토콜을 시연하겠습니다.

멸균된 0.1% 젤라틴 용액 25 milliliters를 정제된 알긴산 나트륨 275 milligrams가 들어 있는 멸균된 50 milliliter 튜브에 넣고, 볼텍스(vortex)하여 알긴산 분말을 부분적으로 용해시킵니다. 그다음 튜브를 오비탈 믹서(orbital mixer)에 놓고 10 times G에서 하룻밤 동안 반응시킵니다. 이어서 알긴산 용액에 9% 멸균 염화나트륨을 첨가합니다.

30초 동안 볼텍싱한 후 95 ×g에서 5분간 원심분리합니다. 알긴산 용액을 4 °C에서 보관하십시오. 먼저 암실 환경에서, 10 µM의 ROCK 억제제가 첨가된 배양 배지로 인간 배아 줄기 세포를 전처리합니다.

37°C에서 2시간 동안 배양합니다. 이제 세포를 효소적으로 분리하기 위해 DPBS로 두 번 세척합니다. accutane을 첨가하고 10분 동안 배양합니다.

37 °C에서 세포 스크레이퍼를 사용하여 세포를 조심스럽게 수확한 후 15 mL 튜브로 옮깁니다. SL 배지를 Accutane과 동일한 부피로 넣어 Accutane을 중화시킵니다. 그런 다음 중화된 세포를 40 µm 필터에 통과시켜 새로운 50 mL 원심분리 튜브에 담습니다.

이제 혈구계수기(hemo cytometer)를 사용하여 세포 수를 측정합니다. 원심분리를 통해 세포를 침전시킨 후, 상층액을 조심스럽게 제거합니다. 그런 다음 미리 데워둔 완충액으로 세포를 한 번 세척합니다.

0.9% 염화나트륨. 원심분리하여 상층액을 제거하십시오. 인간 배아줄기세포를 캡슐화하려면, 우선 예열된 알긴산 용액으로 세포를 재부유시키십시오.

이를 위해, 20 milliliter 주사기를 부드러운 플라스틱 튜브에 연결하고 알긴산염을 주사기로 흡입합니다. 그런 다음 기포가 생기지 않도록 주사기를 사용하여 세포 현탁액을 부드럽게 혼합합니다. 이제 세포를 주사기로 흡입합니다.

플라스틱 튜브를 폐기한 후 캡슐화 기기에 시린지를 장착하십시오. 비드 생성기, 시린지 펌프, 공기 흐름 측정기 및 염화칼슘 침전조의 기기 설정을 진행하십시오. 캡슐화 기기의 끝단과 페트리 접시 수집 지점 사이에 10 centimeter 간격이 있는지 확인하십시오.

다음으로, 시린지 펌프를 10 milliliters per hour로 설정하십시오. 공기 유량은 eight liters per minute, 압력은 100 kilo pascals로 설정합니다. 캡슐화된 세포를 미리 데워둔 침전조에 7분 동안 수집하십시오.

그 다음, 완만하게 흡입하여 20 mL의 0.9% Sodium chloride가 들어 있는 50 mL 원심분리 튜브로 옮깁니다. 캡슐이 튜브 바닥에 가라앉을 때까지 기다린 후, 상층액을 조심스럽게 제거하고 0.9% Sodium chloride로 한 번 세척합니다. 이어서 락-억제제(rock inhibitor)가 첨가되어 미리 데워둔 배양액에 캡슐화된 세포를 재현탁합니다. 배양 플라스크로 옮겨 3일 동안 배양합니다.

마우스 기질 세포주 PA six 세포를 0.1% 젤라틴으로 코팅된 T 75 플라스크에 접종하고, 도파민성 신경 분화 배지로 24시간 동안 배양하여 조건화합니다. 캡슐을 50 mL 원심분리 튜브로 옮기고 튜브 바닥에 가라앉을 때까지 둡니다. 상층액을 제거하고 PA six 세포 조건화 도파민성 신경 분화 배지에 캡슐을 재현탁합니다.

배지 배양. 캡슐화된 인간 배아 줄기세포를 PA 6 세포 단층과 함께 21일 동안 배양합니다. 배지를 보충할 때 배지를 교체하십시오.

도파민성 신경 분화 과정에서 PA 6 세포를 계속 배양하기 위해 매번 배지의 절반만 교체합니다. 유도 인자가 첨가된 배지를 일주일 동안 처리합니다. 먼저 캡슐을 흡입하여 15 mL 원심 분리 튜브로 옮깁니다.

캡슐이 바닥에 가라앉으면 상층액을 버립니다. DPBS로 두 번 세척하고 상층액을 버립니다. 그런 다음 5 mL의 적혈구 제거 용액(decapululating solution)을 넣고 현탁액을 충분히 혼합합니다.

실온에서 5분 동안 배양합니다. 펠렛을 원심 분리한 후, decap 세포를 회수하고 DPBS로 2회 세척한 다음, 해당 decap 세포를 단층 배양에 사용하거나 즉시 하위 분석을 진행합니다. 전형적인 준비 과정에서 알지네이트 마이크로캡슐의 직경은 400에서 500 microns 사이입니다.

여기서는 C-F-D-A-P-I 분석법을 사용하였습니다. 결과에 따르면, 80%의 생존 분석에서 캡슐화된 세포의 녹색 생존 세포가 확인되었으며, 다양한 시점에서 캡슐화된 인간 배아줄기세포의 생존력, 증식 및 세포사멸을 분석하여 배양 조건을 최적화하였습니다. 흥미롭게도, rock 억제제의 효과가 해리 유도 세포사멸을 방지하고 세포 생존력을 유지시켰으며, H-F-F-C-M 및 ri가 첨가된 배지에서 배양된 캡슐화 인간 배아줄기세포의 성장이 더욱 우수함을 나타냈습니다.

본 예제에서는 세포 캡슐화를 3D 플랫폼으로 적용하여 캡슐화된 인간 배아줄기세포를 도파민성 뉴런으로 분화시킵니다. 예상대로 캡슐화된 세포 내 배아체의 크기는 시간이 경과함에 따라 증가하며, 배양 2~3일 후에는 90% 이상의 생존율과 함께 점진적인 뉴런 형태를 나타냅니다. 유전자 발현 분석 결과, 다능성 마커인 OCT four의 발현이 하향 조절되는 것으로 나타납니다.

중요한 점은, 신경 전구세포 마커인 PAC six와 도파민성 신경세포 마커인 th가 분화 7일 후에도 계속 상향 조절된다는 것입니다. 추가로 분화시킨 인간 배아 줄기세포는 21일 후 TH 양성 신경세포가 90% 이상임을 나타냅니다. 웨스턴 블롯 분석을 통해 2D 세포 배양 시스템 대비 3D 시스템에서 TH와 PAC six의 유리한 발현 패턴을 확인하였습니다.

이 기술을 숙달하면 2시간 이내에 효과적으로 수행할 수 있습니다. 캡슐화 전후에 락(rock) 억제제로 세포를 처리해야 함을 기억하십시오. 향후 실험을 위해 변이 유도제나 억제제를 사용하여 3D 분화 프로토콜을 맞춤 설정할 수 있습니다.

이 특정 기술은 인간 ESL을 캡슐화하여 3D 환경에서 분화시키거나, 다수의 질환, 특히 파킨슨병의 세포 치료 가능성을 위해 사용됩니다.