DNA 손상 감지를위한 세미 인공 분자 기계 및 이용 체외 조립에

이 절차의 전반적인 목표는 조직 절편에서 두 가지 주요 유형의 DNA 절단을 표지하는 이중 표지 DNA 손상 센서를 조립하고 사용하는 방법을 시연하는 것입니다. 이 센서는 ZI와 Rumine으로 이중 표지된 30 tumor DNA 올리고뉴클레오타이드와 자가 조립되는 효소인 vaccinia topo isomerase one(또는 vac topo)로 구성됩니다. VAC topo가 30 tumor에 결합하면 기계적 작동이 시작되며, topo가 인식 서열의 3' 말단에서 올리고뉴클레오타이드를 절단하여 vac topo 활성 fitzy 표지 단위와 amine 표지 유리 헤어핀을 생성합니다.

말단 3'-하이드록시기로 인해, 이 단위들은 수명이 짧으며 빠르게 원래의 구조로 다시 조립된 후 다시 절단됩니다. 추가적인 분자 DNA 단절이 없는 경우, 이 두 단위는 주기적으로 계속해서 분리되고 결합합니다. 분자 센서를 DNA 손상이 있는 조직 절편에 적용하면, Fitz 표지 검출 단위가 5'-하이드록시기를 가진 평활 말단 DNA 단절 부위에 선택적으로 부착됩니다.

R 도메인이 표지된 검출기 유닛은 5' 말단 인산화 둔탁 끝 절단 부위(five-prime phosphate blunt ended break)에 결합합니다. T4 DNA Ligase가 존재하면, 형광 현미경을 통해 세포 내 DNA1 및 DNA2 유형 DNA 절단의 존재와 분포를 보여주는 결과를 얻을 수 있습니다. TUNEL과 같은 기존의 DSB 검출 방법과 비교했을 때 이 기술의 주요 장점은 특이성이 더 높으며, 세포 자율적 및 포식성 세포 사멸 단계를 모두 표지함으로써 추가적인 정보를 제공한다는 점입니다.

나노기술 관점에서 이 센서는 실제 생물학적 구조와 설계를 활용하여 무독성 분자 규모의 장치를 제작하는 바이오 기반 접근 방식을 보여줍니다. 일반적으로 이 방법이 생소한 연구자는 고활성 Toro SOM 조제물을 사용하고 proteinase K에 의한 과도한 소화를 방지하기 위해 절편을 적절히 처리해야 하는 점 때문에 어려움을 겪을 수 있습니다. 이 절차를 위한 조직 절편은 분자 장치를 조립하기 전에 준비해야 합니다. paraldehyde로 고정한 조직에서 5~6 µm 두께의 절편을 제작합니다.

파라핀 고정 조직 블록 사용을 권장합니다. 조직 절편이 놓인 슬라이드를 슬라이드 랙에 넣고 15분 동안 자일렌에서 왁스를 제거합니다. 15분 후, 새로운 자일렌 조에 옮겨 5분 동안 더 처리합니다.

슬라이드를 다음의 단계별 에탄올 농도에 통과시켜 절편을 재수화합니다. 96% ethanol에서 5분씩 2회 처리합니다. 80% ethanol에서 5분간 처리한 후, 물로 세척합니다.

각 5분씩 두 번 수행합니다. 재수화 후 proteinase K로 절편을 처리합니다. 절편당 50 µg/mL 용액 100 µL를 사용하여 습윤 챔버 내의 상온에서 15분 동안 배양합니다. 조직 유형에 따라 처리 시간을 조정해야 할 수도 있으나, 과도한 처리는 신호 소실 및 절편 훼손을 유발하므로 처리가 완료되면 주의하여 중단하십시오.

슬라이드를 증류수로 10분씩 2회 헹굽니다. 프리 블로킹을 위해 2% BSA를 도포하고 가습 챔버 내 실온에서 15분간 배양합니다. 이 시간 동안, 비디오의 다음 장면에 나오는 것과 같이 분자 기계를 조립합니다.

분자 기계 조립을 위한 모든 시약은 평균 크기의 조직 절편에서 1회 검출하기에 충분한 총 부피 25 microliters에 맞춰 설정되었습니다. 필요에 따라 작은 플라스틱 튜브에서 부피를 늘릴 수 있습니다. 증류수를 사용하여 다음 시약들을 순서대로 혼합하십시오.

15% polyethylene glycol 8,000, T4 DNA Ligase 버퍼, 이중 표지 올리고뉴클레오타이드, vaccinia topoisomerase one 및 T4 DNA Ligase를 피펫팅하여 부드럽게 혼합합니다. 이 용액 내에서 분자 구조체가 거의 즉각적으로 자가 조립되며, 실온에서 즉시 사용할 수 있습니다. DNA 절단 부위 표지 절차를 시작하려면 슬라이드에서 사전 블로킹 용액을 흡입하여 제거하십시오.

각 섹션에 25 µL의 전체 반응 혼합물을 도포합니다. 섹션 위에 플라스틱 커버 슬립을 덮고 슬라이드를 가습 챔버에 넣습니다. 챔버를 알루미늄 호일로 감싸 빛으로부터 보호한 후, 실온에서 1시간 동안 배양합니다.

1시간의 배양 후에 ligase와 topo 신호가 모두 관찰될 수 있지만, 많은 경우 ligase 신호를 더욱 강화할 수 있습니다. 신호를 강화하려면 vac topo와 oligonucleotide one을 제외하고 oligonucleotide three와 T four DNA Ligase가 포함된 반응 혼합물을 다시 처리한 후, 절편 위에 플라스틱 커버슬립을 덮고 습윤 챔버에서 18시간 동안 배양하십시오. 다음 날 상온에서 슬라이드를 상온의 물이 담긴 coplan jar에 수직으로 조심스럽게 담가 커버슬립을 제거하십시오.

그런 다음 절편을 증류수로 10분씩 3회 세척합니다. 중탄산나트륨 완충액으로 절편을 헹굽니다. 이 알칼리성 용액 헹굼 단계는 pH에 민감하며 pH 7 미만에서 현저히 감소하는 fitzy 형광을 강화합니다.

마지막으로, 대조군을 위한 DPI가 포함된 항퇴색 용액으로 절편을 덮고 핵을 염색한 후 커버슬립을 덮습니다. 이제 절편은 형광 현미경 관찰 준비가 되었습니다. 이 그림은 덱사메타손을 처리한 흉선 조직 절편으로, 분자 기계가 세포 사멸이 진행 중인 흉선 피질 영역에서 DNA 1 및 DNA 2 유형의 평활 말단 DNA 절단을 검출한 결과입니다. 녹색 세포질 형광은 DNA 2 유형의 절단을 나타내며, 이는 사멸하는 흉선 세포의 핵 물질을 소화하는 피질 대식세포를 표시합니다.

이 신호는 vac topo에 의해 생성되며, 5' hydroxyl을 포함하는 DNA가 있는 FGA 리소좀에 국소화됩니다. 이중 가닥 절단은 DNA의 한 가지 유형의 절단을 표시하는 적색 형광으로 나타나며, 대식세포에 의해 포식되지 않은 세포사멸 흉선세포의 핵을 나타냅니다. 수많은 흉선세포가 동시에 세포사멸을 일으킵니다.

리가아제 기반 표지로 시각화된 5개의 프라임 인산 이중 가닥 절단 생성과 동반됩니다. 이러한 절단은 핵 주변부에 위치하며 고리 모양의 패턴을 형성합니다. 모든 세포핵은 dpi 대조 염색을 통해 파란색으로 시각화되었습니다.

이 절차를 수행할 때, 서로 다른 용액을 추가하는 사이에 절편이 마르지 않도록 주의하는 것이 중요합니다. 또한, 모든 효소 조제물은 절편에 추가하기 전까지 얼음 위에 보관하고, 형광 프로브는 라벨링 반응 및 현상 과정 동안 빛으로부터 보호하십시오. 이 기술을 통해 헤테로 세포 분해의 모든 단계를 시각화할 수 있었습니다.

이 센서 자체는 나노 크기의 입자, 프로브 및 기계 설계에 있어 그린 나노테크(green nanotech) 접근 방식의 한 예를 보여줍니다. 이 접근 방식은 인공 구성 요소와 자연적으로 발생하는 분자 기계 부품을 결합합니다. 그 목적은 이러한 고분산 나노 물질의 독성과 부정적인 생물학적 반응성을 제거하는 것입니다.