의 샘플 준비

본 절차의 목적은 NMR 메타볼로믹스를 통해 Mycobacterium tuberculosis의 무세포 추출물을 분석하는 것으로, 먼저 적절한 성장 단계에서 세포를 배양하고 수확합니다. 그 다음 세포를 용해하여 분석을 위한 무세포 추출물을 얻습니다. 동결 건조된 추출물을 NMR 분석용 버퍼에 재현탁합니다.

마지막으로, NMR 데이터를 수집하고 소프트웨어로 스펙트럼을 분석하여 대사물을 확인합니다. 최종적으로, mycobacterium tuberculosis의 NMR 분석은 다양한 처리 후 대사물 수준의 보존 상태를 나타내는 데 사용됩니다. NMR 대사체학은 주요 대사 경로와 같은 mycobacterium tuberculosis 생리학의 핵심적인 측면에 적용될 수 있습니다.

이러한 이해는 약물 작용 및 내성 기전을 규명하고 약물 설계를 위한 새로운 표적을 식별하는 데 매우 중요합니다. 일반적으로 이 방법에 익숙하지 않은 개인은 모든 시료를 완전히 동일하게 처리하지 못해 불필요한 변동성이 발생하고, 결과적으로 실험실 결과에 영향을 줄 수 있어 어려움을 겪을 수 있습니다. 대학원생 Steven Luka 박사 과정생이 NMR 처리를 위한 시료 취급 절차를 시연하겠습니다. 이어서 본 실험실의 연구실 관리자와 연구 기술원 3급인 Robert Fenton이 M tuberculosis를 다룰 때의 mycobacterium tuberculosis 배양물 취급 절차를 시연하겠습니다.

연구는 기관 지침에 정의된 생물안전 3등급(biosafety level three) 절차를 준수하여 수행되었습니다. 생물안전 고려 사항으로 인해 본 영상의 라벨에는 microbacterium tuberculosis라고 표시되어 있으나, 이 시연에서는 비병원성 mycobacterium magmatic을 사용하였습니다. 먼저 50% glycerol stock의 M tuberculosis를 얼음 위에서 해동하며 시작하십시오.

0.15 milliliters를 250 milliliter ER-flask 내의 110 milliliters M-A-D-C-T-W broth에 접종하고, 37 degrees Celsius에서 100 RPM으로 진탕하며 약 6일 동안 배양합니다. 항생제, 대체 첨가제 또는 기타 처리가 필요한 경우, 해당 처리가 요구되는 배양물을 수확합니다.

배양, 적정 및 품질 관리를 위해 0.5 mL의 Eloqua를 얼음 위에 보관하십시오. 그 다음 원하는 처리를 수행하고, 처리 시간이 지난 후 배양액을 다시 쉐이커에 넣으십시오. 1 mL를 취해 OD 600을 측정하십시오.

또한, 배양, 적정 및 품질 관리를 위해 0.5 milliliter 샘플을 따로 확보하십시오. 나머지 모든 프로토콜 과정 동안 세포를 얼음 위에 유지하십시오. 15 milliliter의 얼음처럼 차가운 2차 증류수로 세척한 후, 원심 분리를 통해 세포를 4개의 50 milliliter 튜브에 수확하십시오.

Reese는 펠렛을 10 mL씩 분주하여 현탁합니다. 두 개의 분주액을 취해 원심분리로 펠렛을 형성한 다음, 최종 부피 1 mL의 2중 증류수에 세포 펠렛을 재현탁합니다. 뭉침 없는 단일 세포 현탁액이 필요한 경우, 27 gauge 바늘을 통해 세포를 통과시킵니다.

1 mL의 세포 현탁액을 lysing matrix B가 포함된 2 mL 스크류 캡 튜브에 세 번 나누어 옮깁니다. FastPrep 24 용해 균질기를 생물안전작업대(biosafety cabinet) 내에 배치합니다. 샘플 홀더에 샘플을 넣고 고정 스포크 플레이트(retention spoke plate)를 고정합니다. 그런 다음 6 m/s의 속도로 60초 동안 처리합니다.

다음으로, 샘플을 원심분리하여 세포 잔해와 온전한 세포를 펠렛화합니다. 그런 다음 상층액을 0.2 micron 시린지 필터로 걸러 멸균 튜브에 옮겨 생존 세포가 없음을 확인합니다. 샘플 0.1 milliliter를 MADC.Agar에 도말합니다.

에탄올 드라이아이스 배스에서 샘플을 급속 냉동한 후, 동결 건조 및 NMR 시설 내 분석 준비가 될 때까지 -80°C에서 보관합니다. 2개월 후, 플레이트를 확인하여 콜로니 형성 단위(CFU)가 없는지 검증합니다. CFU가 발견되지 않으면, 해당 샘플을 BSL 3 실험실에서 반출하여 표준 NMR 시설에서 추가 분석을 진행할 수 있습니다.

샘플을 완전히 건조시킨 후, 0.7 mL의 NMR 버퍼로 재현탁하고 마이크로 원심분리 튜브로 옮겨 13,000 ×g에서 3분 동안 원심분리합니다. 0.6 mL를 취해 5 mm NMR 튜브로 옮깁니다. 분석 매체에서 제공하는 맞춤형 랙을 사용하면 여러 개의 NMR 튜브를 적절한 깊이로 스피너에 쉽게 장착할 수 있습니다.

그런 다음 샘플을 NMR 분광기로 옮겨 A-B-A-C-S one 20 샘플 체인저에 삽입합니다. 이때 처리하지 않은 배양액과 약물 처리된 배양액을 교대로 배치합니다. 첫 번째 샘플은 자동 런(run) 시작 시 마그넷에 미리 로드되어 있어야 합니다.

기기를 교정하려면, 단일 샘플을 사용하여 90도 펄스 길이를 최적화하고 나머지 샘플에 대해 기기를 튜닝하십시오. icon NMR 및 grad shim을 사용하십시오. 모든 샘플에 대해 록킹, 시밍 및 NMR 데이터 수집을 자동화하십시오.

1D ¹H NMR 스펙트럼을 위해 워터 서프레션(water suppression)과 엑사이테이션 스컬프팅(excitation sculpting)이 포함된 펄스 시퀀스를 선택하십시오. 2D ¹H-¹³C HSQC 스펙트럼의 경우, 총 데이터 포인트 32,000개, 스캔 횟수 128회, 더미 스캔 16회로 설정하십시오. 해당 펄스 시퀀스를 선택하십시오.

직접 H 차원을 따라 스윕 폭(sweep width)을 가진 총 2048개의 데이터 포인트를 선택하고, 간접 C 13 차원을 따라 스윕 폭을 가진 64개의 데이터 포인트를 선택하십시오. 또한, 양호한 신호 대 잡음비를 얻기 위해 128회의 스캔과 16회의 더미 스캔으로 스펙트럼 수집을 지정하십시오. m tuberculosis의 스펙트럼에서는 50개의 알려진 대사물을 포함하여 약 400개의 피크가 생성되었습니다.

예를 들어, 함께 제공된 원고에 상세히 기술된 데이터 처리 과정을 통해 D alanine 경로와 직접 또는 간접적으로 연관된 이러한 대사체 스펙트럼을 얻었습니다. 피크 강도의 크기는 세포 추출물에 존재하는 대사체 농도에 비례하므로, 시료 및 처리군 간의 대사체 및 대사 경로의 상대적 변화를 정량화할 수 있습니다. LMR 대사체학은 세균학 분야의 연구자들이 시각적 및 미세 세균, 또는 다른 병원성 및 비병원성 미생물의 생리와 병원성을 탐구할 수 있는 길을 열어줍니다.

이 영상을 시청한 후에는 NMR 대사체학 분석을 위해 여러 개의 결핵균 세포 추출물을 준비하는 방법과, 신뢰할 수 있는 결과를 얻기 위해 전체 프로토콜 전반에 걸쳐 일관성을 유지하는 것이 얼마나 중요한지에 대해 충분히 이해하게 될 것입니다.