표면 Plasmon 공명하여 호스트 Cytosol에 독소를 Translocation의 감지

본 절차의 전반적인 목표는 세포질로 유입되는 독소 풀을 검출하고 정량화하는 것입니다. 이를 위해, 먼저 4°C에서 독소를 숙주 세포 표면에 결합시킵니다. 그다음 결합되지 않은 독소를 제거하고 세포를 37°C로 가온하여 독소가 세포내막계 및 결과적으로 숙주 세포질로 이동할 수 있도록 합니다. 세포 투과 후에는 digitonin을 사용하여 세포막을 선택적으로 투과성 있게 만듭니다.

세포 추출물은 분별 원심분리를 통해 별도의 막 분획과 세포질 분획으로 나누어집니다. 마지막 단계로, 항독소 항체가 코팅된 SPR 센서 위로 세포질 분획을 흘려보내는 표면 플라즈몬 공명(Surface Plasma Resonance, SPR) 분석을 사용하여 세포질로 유입된 독소를 검출하고 정량화합니다. 이 방법은 세포질로의 독소 유입 효율 및 역학, 세포질로 유입되는 독소의 양, 그리고 세포질로의 독소 이동에 대한 잠재적인 약물 억제 효과와 같이 독소 생물학 분야의 핵심 질문들에 답하는 데 도움이 될 것입니다. 이 프로토콜을 시작하기 전, HeLa 세포를 하룻밤 동안 배양한 후 서면 프로토콜에 설명된 대로 세포 독성 처리를 위한 HeLa 세포를 준비하십시오.

배양액을 100 ng/mL의 Ganglioside GM1이 포함된 DMEM 1 mL로 교체하고 37 °C에서 1시간 동안 배양합니다. 이는 콜레라 독소의 결합 부위 수를 증가시킵니다. GM1 용액에 노출된 세포의 세포막으로 독소의 GM1 수용체가 삽입되기 때문입니다.

1시간 동안 배양한 후, 배지가 포함된 GM one을 제거하고 DMEM으로 세포를 2회 세척합니다. 그 다음, 1 µg/mL의 콜레라 독소가 포함된 DMEM 1 mL를 첨가하고, 4 °C에서 30분 동안 세포를 둡니다. 독소가 포함된 배지를 제거하고 세포를 2회 세척합니다.

그런 다음 37°C에서 1mL의 DMEM으로 원하는 시간 동안 세포를 배양합니다. 각 체이스(chase) 기간이 끝나면 PBS로 세포를 세척한 후, 각 웰에 250µL의 0.5mM EDTA 및 PBS를 넣어 배양합니다. 얼음 위에서 10분 동안 배양한 후, P1000 피펫맨으로 강하게 트리튜레이션(trituration)하여 6-웰 플레이트에서 세포를 수거합니다.

세포가 수집된 한 개의 웰을 동일한 조건의 두 번째 및 세 번째 웰과 합칩니다. 그다음, 세 개의 반복 웰에서 합쳐진 세포 현탁액을 하나의 마이크로 원심분리 튜브에 넣습니다. 이제 벤치탑 마이크로 원심분리기를 사용하여 마이크로 원심분리 튜브를 5분 동안 원심분리합니다.

5,000 ×g에서 원심분리하면 모든 조건에서 거의 동일한 크기의 세포 펠릿을 얻어야 합니다. 상층액을 제거한 후, 미리 준비하여 냉각시킨 0.04% digitonin 작업 용액 100 µL에 세포 펠릿을 재현탁합니다. 세포 현탁액을 얼음에 10분간 둡니다. 탁상용 마이크로 원심분리기를 사용하여 digitonin 처리되어 투과성이 된 세포를 16,000 ×g에서 10분 동안 원심분리합니다.

상청액 분획이 포함된 세포질을 새 마이크로 원심분리 튜브로 옮기고, 소기관이 포함된 펠릿 분획은 보관합니다. SPR 독소 표준물질은 HCN 완충액에서 110, 1 및 0.1 ng/mL 농도로 준비합니다. 상청액 분획이 포함된 세포질을 HCN 완충액으로 희석하여 최종 부피가 1 mL가 되도록 시료를 준비합니다. 주입 전 500 µL 시료 루프에서 공기가 완전히 제거되도록 하려면 최소 1 mL 이상의 시료 부피가 필요합니다. 소기관이 포함된 펠릿 분획은 1% Triton X 100이 포함된 1 mL의 HCN 완충액에 재현탁합니다.

막으로 둘러싸인 독소 풀을 방출하기 위해 계면활성제 첨가가 필요합니다. 또한 분획 절차의 정확성을 확인하기 위한 대조 실험용으로 세포질 및 organ L 분획의 병렬 세트를 준비하십시오. 세포질 분획은 20 µL의 4x 샘플 버퍼에, organ L 분획은 120 µL의 1x 샘플 버퍼에 각각 재현탁하십시오. 각 분획의 동일한 부피를 SDS-PAGE(sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis)로 분리하고 Western blot 분석으로 탐지하여, 세포질 단백질이 상층액 분획으로, 가용성 상주 ER 단백질이 펠렛 분획으로 분배되었음을 입증하십시오. SPR 슬라이드를 준비하려면 먼저 자기 조립 단분자막이 형성된 금 도금 유리 슬라이드를 SPR 장치에 장착하십시오.

41 µL/min의 유속으로 E-D-C-N-H-S 용액을 슬라이드 위로 10분 동안 흘려주어 센서 슬라이드를 활성화합니다. 이후의 모든 퍼퓨전(perfusion) 단계에서는 동일한 유속을 사용합니다. 0.05% Tween 20이 포함된 PBS로 플레이트를 5분 동안 세척하여 E-D-C-N-H-S 활성 버퍼를 제거합니다.

E-D-C-N-H-S 용액에 의한 언캡핑(uncapping)으로 인해 현재 플레이트에는 반응성 MI 테더가 포함되어 있습니다. 다음으로, 20 millimolar sodium acetate에서 1:20,000으로 희석한 anti CTA 항체를 활성화된 센서 슬라이드 위에 15분 동안 흘려줍니다. pH 변화로 인해 굴절률 단위(RIU로 약칭)의 초기 감소가 관찰될 것입니다.

이후 항체가 아미드 반응성 테더에 포획됨에 따라 RIU가 증가하게 됩니다. 센서 슬라이드에서 5분간의 PBST 세척을 통해 결합되지 않은 항체를 제거하십시오. 포획된 항체에 의해 생성된 RIU 신호는 고점에 도달하여 안정화되며, 이를 통해 새로운 기선 신호를 제공하게 됩니다.

슬라이드 준비의 마지막 단계로, 1 M 에탄올아민을 센서 슬라이드 위로 5분 동안 흘려줍니다. 이는 센서 슬라이드에 남아 있는 결합되지 않은 테더(tether)를 캡핑하여 비활성화합니다. RIU 신호가 증가하며 기준선(baseline) 수치가 설정되면, 항체가 코팅된 센서 위로 PBST를 5분 동안 흘려줍니다.

그 후, 실험 샘플 또는 독소 표준물을 센서 위로 300초 동안 흘려줍니다. 버퍼에서 리간드를 제거하고 PBST를 센서 위로 다시 200초 동안 흘려줍니다. 센서에 결합되어 남아 있는 모든 독소는 pH 5.0의 PBST로 102번째 세척을 통해 제거합니다.

이렇게 하면 신호가 초기 기저선 읽기 값으로 돌아가므로 동일한 센서에서 다른 샘플을 처리할 수 있습니다. 새 샘플을 로드하기 전에 샘플 루프를 통해 소량의 공기를 밀어 넣어 이전 샘플의 잔류액을 모두 배출하십시오. 획득 후.

데이터는 scrubber two 소프트웨어로 분석할 수 있으며, Igor 소프트웨어는 그림 작성에 사용할 수 있습니다. 백일해 독소(Pertussis toxin)는 AB 독소로, a 사슬이 세포질로 들어가기 전 세포 표면에서 소포체(ER)로 이동합니다.

SPR 기반의 전위 분석법을 통해 독소에 노출된 CHO 세포의 세포질 내 PTs를 검출할 수 있었습니다. 독소에 노출되지 않은 세포의 세포질에서는 신호가 생성되지 않았으며, 이는 anti PTs의 선택성을 확인시켜 주었습니다. 이는 항체가 숙주 세포질의 구성 요소와 교차 반응하지 않았음을 나타냅니다.

felden이 존재하는 상태에서 독소에 노출된 세포의 세포질 분획입니다. A 또한 양성 신호를 생성하지 못했으며, BFA는 소포체(ER) 전위 부위로의 독소 수송을 막아 결과적으로 H 사슬의 세포질 전달을 방해합니다. Chole toin은 또 다른 AB형 소포체 전위 독소입니다.

CT 처리된 helo 세포의 세포질 분획에서 CTA1이 검출되었습니다. 이는 본 방법론이 여러 세포 유형에 적용 가능하며, 항-체인 항체가 존재하는 모든 독소에 적용될 수 있음을 강조합니다. CT 처리된 세포의 세포질 분획을 anti-CTB 항체가 코팅된 SPR 센서 위로 흘렸을 때 신호가 검출되지 않았으며, 이는 CTA1 서브유닛과 달리 세포 결합 CTB PENTAMER는 세포질로 들어가지 않음을 입증합니다.

anti CTA 항체가 코팅된 SPR 센서상에서 확산시킨 후의 결과입니다. 세포소기관 분획에서 얻은 신호는 세포질 분획의 약한 신호와 비교했을 때 측정 범위를 벗어날 정도로 강하게 나타납니다. 이는 소포체(ER) 전위 부위로의 CT 수송 효율이 낮아 세포질로 도달하는 독소의 양이 제한적이라는 알려진 사실과 일치합니다.

전위된 세포질 독소의 시간 의존적 축적 또한 모니터링할 수 있습니다. 4°C에서 CT에 세포를 노출시킨 후, 37°C로 가온하고 15분이 지날 때까지 세포질에서 독소가 검출되지 않았습니다.

37°C에서 30분 후 세포질 내 소량의 독소가 검출되었으며, 45분 및 60분 추적 간격 후에는 세포질 독소의 양이 점진적으로 더 많이 검출되었습니다. 이는 세포와 결합된 독소가 숙주 세포질로 지속적으로 장기간 전달됨을 입증합니다. 이 분석법은 세포질로의 독소 전위 억제 또한 검출할 수 있으며, 10% DMSO로 처리한 세포는 독소의 언폴딩이 억제되어 처리되지 않은 독소 처리 대조군 세포에 비해 CT1과 같은 세포질 내 독소 수준이 낮게 나타났습니다.

사슬 구조는 세포질로의 전위(translocation)를 위한 전제 조건이므로, DMSO에 의한 CT A1의 안정화는 그에 따라 소포체(ER)에서 세포질로의 이동을 방지하였습니다. DMSO로 유도된 독소 전위 차단을 정량화하기 위해, 기지 농도의 독소로 생성한 표준 곡선을 사용하여 세포질 내 cta1 농도를 계산하였으며, 그 결과 처리하지 않은 세포는 0.3 ng/mL, DMSO 처리 세포는 0.1 ng/mL로 나타났습니다. 따라서 DMSO에 의한 CT A1 언폴딩(unfolding) 억제는 CTA1의 소포체에서 세포질로의 전위를 3배 감소시켰습니다.

이 절차를 통해, 세포질 내 독소의 양과 독소 활성 사이의 직접적인 연관성을 입증하기 위해 독성 분석과 같은 다른 기술들을 활용할 수 있게 됩니다.