태아 알코올 노출의 Zebrafish 모델에서 Teratogenic 변경 사항 평가

이 실험 절차의 전체적인 목적은 에탄올 노출이 발달 중인 제브라피쉬에 미치는 영향을 연구하는 것입니다. 이를 위해 먼저 초기 발달 단계의 제브라피쉬를 일반 배아 배양액에 포함된 에탄올 용량에 노출시킵니다. 그 다음, 에탄올을 제거하고 물고기가 원하는 시점까지 성장하도록 합니다.

그런 다음, 대조군 배아와 비교하여 처리군 배아에서 외형적인 물리적 변화와 유전자 발현의 변화를 모두 분석합니다. 마지막으로, 에탄올로 유도된 발달 결함이 변화될 수 있는지 확인하기 위해 mRNA, morpholino 또는 약물을 사용하여 배아를 조작합니다. 궁극적으로, quantitative PCR과 in situ hybridization의 조합을 통해 발달 중인 제브라피시 배아에 미치는 에탄올의 영향이 유전자 발현 변화와 연관되어 있음을 보여줍니다.

이후 유전자 발현 수준을 조절함으로써 에탄올로 유도된 발달 결함을 개선하거나 예방할 수 있습니다. 오늘 시연할 기술은 태아 알코올 증후군의 본질에 대한 지식을 확장할 뿐만 아니라 척추동물의 발달 과정을 보존합니다. 배아에 에탄올을 처리하는 과정은 저희 실험실의 기술원인 Steph Erhardt가 시연하겠습니다.

야생형 교배를 통해 배아들을 배아수로 채운 28 °C 인큐베이터에서 돔 단계까지 배양합니다. 한 클러치의 배아들을 디시당 10~50개씩 나누어 원하는 개수의 디시에 분배합니다. 어류수로 희석하여 부피 비율 0.2~2.5%의 에탄올 용액을 배아에 첨가하고, 원하는 노출 시간이 지난 후 최대 24시간 동안 인큐베이터로 되돌려 둡니다.

정량적 PCR을 위한 mRNA를 수집하기 위해, 배아의 특정 발달 기간 동안 물을 포함한 에탄올을 신선한 배아 배양액으로 교체합니다. H matched 배아를 에펜도르프 튜브에 넣습니다. 어류 배양액을 제거하고 TCEP가 포함된 용해 버퍼를 추가합니다.

전동 분쇄기를 사용하여 배아를 물리적으로 해리시킨 후, 원심분리기에 넣고 저속으로 회전시킵니다. 용해물을 프리클리어 컬럼(pre-clear column)으로 옮긴 다음, 컬럼을 원심분리합니다. 이는 해리된 커다란 조각들을 제거하기 위함입니다.

RNA 분리 키트를 사용하여 RNA를 추출합니다. 그런 다음 QPCR 또는 마이크로어레이 분석을 위한 표준 방법으로 cDNA를 합성하여, embryo를 *in situ* hybridization 및 항체 염색에 맞게 준비합니다. PBS 및 0.1% tween으로 3회 세척한 후, 수정 후 6~24시간이 경과한 embryo를 4% paraformaldehyde에 넣고 4°C에서 하룻밤 동안 고정합니다.

현미경 하에서 날카로운 핀셋 두 개를 사용하여 외배엽(choon)을 제거합니다. 그다음, 메탄올 농도는 높이고 PBT 농도는 낮추는 연속적인 액체 교체 과정을 통해 배아를 메탄올로 옮깁니다. 배아를 100% methanol로 옮긴 후, 연골을 염색하기 위해 -20 °C에서 보관합니다.

배아를 수정 후 5일 또는 6일까지 배양합니다. 4°C에서 4% paraform aldehyde로 하룻밤 동안 고정합니다. 그 다음 PBT로 세 번 세척하여 에탄올 노출에 의해 어떤 유전자 발현 수준이 변화했는지 확인합니다.

먼저 프라이머를 설계하여 검증함으로써 QPCR을 수행합니다. 세 개의 생물학적 샘플을 대상으로 프라이머를 테스트하십시오. 이러한 대조군 생물학적 샘플은 관심 유전자가 해당 연령대에 발현되기만 한다면 어떤 연령대라도 무관합니다.

프라이머 검증이 완료되면, 이전에 준비한 cDNA를 사용하여 qPCR을 수행합니다. 시료는 3회 반복 측정하며, 제브라피쉬 대조군을 위한 대조 시료를 포함합니다. 우리는 gapdh 프라이머를 사용하며, 결과를 gapdh 수준으로 표준화합니다. 그 다음, 2^(-ΔΔCt) 방법을 사용하여 유전자 발현의 상대적 수준을 계산합니다.

야생형 대비 실험군의 차이를 보여주는 두 가지 delta delta CT 변이. C의 경우, 두 가지 하이브리드 작제물. 표적 유전자에 라벨링된 ribo 프로브.

그 다음, 표준 조건에서 연령이 일치하는 배아와 함께 배양하고, 알칼리성 포스파타아제(alkaline phosphatase)를 사용하여 하이브리드화 패턴을 검출합니다. 해부 현미경을 통해 샘플의 이미지를 촬영하여 형태 발생 발달 상태(예: 머리 모양)를 평가합니다. 살아있는 배아의 이미지를 촬영하여 안구 간 거리와 체장을 평가합니다. 먼저, 파라포름알데히드(paraformaldehyde)로 배아를 고정합니다. 그 다음, 유충 염색 단계에서 알코올 처리가 발달 중인 연골 구조에 미치는 영향을 조사하기 위해 이미지를 수집합니다.

이미징 전 배아를 고정하고 투명화하기 위해 lc와 blue를 사용하여 수 시간에서 하룻밤 동안 처리하였습니다. 살아있는 배아의 세포 사멸을 분석하기 위해 PBS에 희석된 5 mg/mL acridine orange 용액에서 1시간 동안 배양하였습니다. 배아를 PBS로 3회 세척한 후 슬라이드에 마운트하고, 공초점 현미경을 사용하여 샘플을 촬영한 뒤 Z-stack을 이용하여 합성 이미지를 생성하였습니다.

에탄올 노출로 인해 발현이 감소한 유전자를 확인한 후, 관심 유전자의 캡핑된 mRNA를 1~2세포 단계에 25~200 pg/nL의 농도로 주입합니다. 알이 돔 단계(dome stage)에 도달할 때까지 28 °C로 가열된 배양기에서 회복시킨 후, 이전과 동일하게 에탄올로 처리합니다. 에탄올 노출 결과 발현이 증가한 유전자의 경우, 1~2세포 단계의 배아에 pg에서 ng 양의 안티센스 모르포(antisense morphos)를 주입하여 발현을 억제합니다.

이 프로토콜은 캡핑된 mRNA에 대한 방법과 유사합니다. mRNA 또는 스플라이싱 morpho를 주입하는 경우, R-T-P-C-R을 사용하여 스플라이싱된 전사체와 스플라이싱되지 않은 전사체의 양을 비교하여 효율을 측정함으로써 용량 의존적 유전자 활성을 분석하십시오. 주입하는 morphino의 농도를 적정하고, 에탄올로 처리하기 전 배아가 원하는 단계까지 발달하도록 하십시오. 제브라피시 배아를 에탄올에 노출시키면 다른 척추동물에서 발견되는 표현형과 관련된 다수의 발달 및 유전적 결함이 나타납니다.

Noor를 포함한 축 조직의 비정상적인 발달은 noord의 단축 및 때때로 단절을 초래하며, 이는 여기에서 보여지는 바와 같이 이후 체절의 이상으로 일부 이어집니다. 처리하지 않은 대조군은 강한 쉐브론(chevron) 모양을 띠는 반면, 에탄올 처리된 체절은 sonic hedgehog 신호 전달이 감소했을 때 나타나는 U자형 외형을 보입니다. 여기에서 확인할 수 있습니다.

에탄올 노출의 또 다른 결과로, 초기 발달 지연 및 그에 따른 신경 결함의 하위 단계에서 발생했을 가능성이 있는 배아 길이의 단축이 나타납니다. 이러한 발견은 발달 과정 중 에탄올에 노출된 아동에게서 발견되는 사춘기 전 단계의 지속 및 저신장증과 유사하며, 이는 제브라피쉬 모델이 이러한 인간 선천성 결함을 이해하는 데 적합함을 시사합니다. 동물 모델을 통해 심각한 에탄올 노출이 소두증(microcephaly) 및 안구 기형(anophthalmia)을 포함하여 뚜렷한 태아 알코올 증후군 표현형을 유발한다는 것이 입증되었습니다.

제브라피시에서 안구 간 거리(intraocular distance, IOD)는 인간의 선천성 결함 특성과 일치하게 에탄올 용량 의존적으로 감소합니다. 안구 결손(Opia)은 매우 고농도의 용량에서만 발견되지만, 저농도 용량에서도 IOD의 유의미한 감소가 나타나며, 이는 이 동물 모델이 안면 정중선 발달에서 유사한 결함을 가지고 있음을 시사합니다. 본 그림에서는 처리하지 않은 배아와 에탄올을 처리한 배아에서 six3b 및 glee1의 초기 유전자 발현 수준을 비교하였습니다.

에탄올 처리된 샘플에서 두 유전자 모두 발현 수준이 감소한 것으로 나타났습니다. NC 두 하이브리드법을 사용하여 six3b 및 gooid의 발현 패턴을 분석한 결과는 다음과 같습니다. 여기서 두 유전자 모두 처리되지 않은 대조군에 비해 에탄올 처리된 배아에서 공간적 발현이 감소한 것을 보여주었습니다.

두 유전자 모두 C 두개안면 중앙선 조직으로 발달할 조직에서 발현되므로, 수정 후 8시간째에 이들의 발현이 감소하는 것은 발달 후기에 IOD가 감소하는 것과 일치합니다. 에탄올의 영향을 받는 유전자가 식별되면, 해당 유전자의 발현을 증가시키거나 감소시킬 수 있는 기전이 존재합니다. 이 예시에서는 gli1 수치를 높이는 리간드인 sonic hedgehog의 mRNA를 주입하였으며, 이를 통해 gli1 감소 및 에탄올 처리 배아에서 나타나는 외형적 결함을 회복시켰습니다.

하지만 six three B를 주입해도 에탄올에 노출된 표현형을 회복시킬 수 없었습니다. 이 영상을 시청하신 후에는 발달 중인 제브라피시 배아에서 에탄올로 인해 발생하는 유전적 및 발달적 결함을 탐구하는 방법에 대해 충분히 이해하셨을 것입니다. 여기서 사용된 기술들은 발달 중인 척추동물 배아에 대한 다른 수용성 화합물의 독성을 연구하고자 하는 분들에게도 적용될 수 있습니다.