질소 산화물 Bioactivity을 시금을위한 분석 기법

다음 실험의 전반적인 목표는 생물학적 시료에서 일산화질소 대사물을 정확하고 특이적으로 검출하는 방법을 시연하는 것입니다. 이를 위해 우선, 대사물의 손실이나 아티팩트(artifact) 형성을 방지하기 위해 채혈 직후 혈액 시료를 처리합니다. 이와 동시에, 저산소 환경이 일산화질소 대사물에 미치는 영향을 최소화하기 위해 신속하고 효율적인 조직 채취를 수행합니다.

대동맥 링을 수집하여 오간 배스(organ bath)에 걸어 내피 기능을 평가합니다. 또한, 생화학적 분석을 통해 조직 내 질산염 수치, 아질산염 수치, 그리고 니트로티올 및 기타 니트로화 생성물의 상대적 수치를 정량화합니다. 이러한 분석법을 사용하여 실험군과 대조군 동물을 적절히 비교함으로써 일산화질소의 생성 및 대사에 관한 유용한 정보를 얻을 수 있습니다.

단일 방법이나 분석법보다 이러한 다중 시스템 접근법을 사용하는 주요 장점은 여러 장기 시스템에서 산화질소 생화학의 더 넓은 전체상을 파악할 수 있다는 점입니다. 이를 통해 이러한 대사산물 중 어떤 것이 예후 또는 진단적 유용성을 가질 수 있는지, 그리고 산화질소 대사산물의 레퍼토리가 내피 산화질소 형성 및 가용성을 어떻게 반영하는지 이해하기 시작할 수 있습니다. 공정의 각 단계가 시료의 무결성을 유지하는 데 매우 중요하므로, 이 방법의 시각적 시연이 필수적입니다.

일반적인 학술지의 방법 섹션만 읽어서는 시료 채취 및 조직 추출의 세부 사항이 매우 정밀하기 때문에 일부 단계들을 명확히 파악하기 어렵습니다. 본 절차의 시연은 저희 실험실의 수석 연구원인 Hong Jing 박사가 진행하겠습니다. 본 프로토콜을 위해 혈액 채취가 가능한 사람 또는 실험 동물을 준비하십시오. 실험 동물을 사용하는 경우, 해당 동물의 조직 또한 함께 검사하게 됩니다.

먼저, 25 gauge 바늘을 하대정맥(inferior vena cava)에 삽입하여 전혈을 수집합니다. 500 to 1000 µL가 수집되면, 좌심실 첨단(apex of the left ventricle)을 통해 생리적 완충액을 주입하여 동물 체내의 잔류 혈액을 제거하며, 혈액과 완충액이 하대정맥을 통해 배출됨에 따라 혈액이 완전히 교체되도록 합니다. 정맥혈은 수집 직후 NEM과 EDTA가 포함된 1.5 mL 원심분리 튜브에 수집해야 합니다.

원심분리 후 14,300 RCF에서 7분 동안 혈액을 회전 분리합니다. 피펫을 사용하여 RBC 펠렛으로부터 혈장을 흡입하고 이를 별도의 튜브로 옮깁니다. 분리된 혈장 샘플 50 µL에 동일한 부피의 차가운 메탄올을 첨가하여 HPLC 분석을 위한 준비를 합니다.

혼합물이 탁해질 때까지 3~5초 동안 강하게 볼텍싱합니다. 그런 다음 14,300 RCF에서 7분 동안 혼합물을 원심분리합니다. 혈장 단백질을 침전시키기 위해 상층액을 별도의 1.5 milliliter 튜브에 수집하고, 분석 전까지 4 °C에서 보관합니다.

화학발광 분석을 위해 혈장을 준비하려면, 약 200 내지 400 µL 정도 남은 혈장 부피를 두 부분으로 나눕니다. 혈장의 절반에 5% 산성 황화물을 부피 기준 10% 추가하고 10분 동안 기다려 준비합니다. 이제 이 시료를 CLD 분석에 사용할 수 있습니다.

5분 후, 2% 염화수은(mercuric chloride)을 10% 부피만큼 첨가하여 플라즈마의 나머지 절반을 준비합니다. 실온에서 산성화된 설폰아마이드(sulfonamide)를 10% 부피만큼 첨가합니다. 다시 10분 동안 기다린 후, 플라즈마와 동일하게 이 시료를 CLD에 주입합니다.

RBC 펠릿은 HPLC 및 CLD 분석 모두를 위해 준비할 수 있습니다. 세포 펠릿 1분량에 저장성 용해액 4분량을 혼합하는 것으로 시작하십시오. CLD 분석을 위해 혼합물을 충분히 볼텍싱하십시오.

세포 준비 과정은 혈장 준비 과정과 동일합니다. 먼저 동일한 부피의 methanol을 첨가합니다. 그런 다음 혼합물을 3~5초간 강하게 vortex한 후, 14,300 RCF에서 7분간 원심 분리합니다.

이제 상층액을 피펫으로 제거하여 4 °C에 보관하고, 이후 HPLC 분석을 통해 조직 내 산화질소 대사물질 수치를 측정합니다. 실험 동물의 해당 관심 조직의 경우, 먼저 이전 섹션에서 설명한 대로 혈액을 채취 및 준비해야 하며, 조직이 저산소 상태가 되지 않도록 속도와 효율성에 각별히 주의하여 평소와 같이 조직을 채취해야 합니다. 채취가 완료되면, NEMEDTA가 포함된 PBS를 1:5 비율로 사용하여 조직 시료를 균질화합니다.

그 후, 이전 섹션의 RBC 분석 방법과 동일하게 균질화된 조직을 HPLC 및 CLD 분석을 위해 준비합니다. 성체 마우스를 에테르로 마취하고 발가락 꼬집기에 반응이 없는 것을 확인한 후, 흉강 절개술을 실시합니다. 흉골부터 치골 부위까지 정중선 절개를 하여 흉강과 복강을 노출시킵니다.

다음으로, 산소화된 Krebs Alite 완충액으로 동물을 관류합니다. 25게이지 주사기를 사용하여 좌심실 심첨부에 완충액을 주입하십시오. 이때 혈액이 배출될 수 있도록 우심방을 절개하여 엽니다.

관류 후, 대동맥을 덮고 있을 수 있는 간, 폐 및 기타 조직을 절개하여 제거함으로써 복부 대동맥을 분리합니다. 다음으로, 핀셋으로 심장을 잡고 동물의 후벽으로부터 대동맥을 조심스럽게 절단하여 분리합니다. 심장과 대동맥을 얼음이 채워진 페트리 접시에 넣습니다.

디쉬에 차가운 Krebs 완충액을 채웁니다. 대동맥에서 지방과 외막을 조심스럽게 절제하여 제거합니다. 세척 과정에서 혈관 내부의 내피세포가 손상되지 않도록 주의하십시오.

5분마다 산소가 공급된 차가운 얼음 버퍼로 교체하여 대동맥의 대사 속도를 늦춤으로써 저산소증을 방지하십시오. 이제 메스를 사용하여 대동맥을 3 mm 길이의 링 모양 세그먼트로 절단합니다. 절단된 세그먼트들을 산소가 공급된 Krebs 버퍼가 채워진 4채널 10 mL 조직 장기 배양조(tissue organ bath)로 옮기십시오.

트랜스듀서 노브를 사용하여 각 대동맥 링에 1.5 grams의 예비 장력을 가합니다. 경험적 연구 결과에 따르면, 최적의 혈관 운동 기능을 위한 적절한 초기 장력은 1.5 grams입니다.

8채널 옥탈 브리지(octal bridge)와 데이터 수집 소프트웨어를 사용하여 마우스의 힘 측정을 모니터링하고 기록하며, 20분마다 버퍼를 교체하면서 80분 동안 링을 평형 상태로 둡니다. 그 후 실험을 진행합니다. 조직 장력이 평형에 도달하면, 하위 최대 수축을 유도하기 위해 각 링에 100 nanomolar fennel rine을 첨가합니다. 링의 장력이 안정화되어 일정 수준의 톤(tone)이 유지되면, acetylcholine과 같은 내피 작용제에 대한 용량-반응 분석을 수행합니다.

이를 통해 일산화질소 생성량과 혈관 이완 정도를 결정합니다. 아세틸콜린에 대한 용량 반응 측정이 끝나면, 욕조를 Krebs 버퍼로 씻어내고 각 장기 욕조에 100 nanomolar 페넬린(fennel rine)을 첨가하여 혈관을 수축시킵니다. 그 후, 가용성 구아닐릴 사이클라아제(soluble guile cyclase) 억제제인 ODQ의 처리 여부에 따라, 소듐 나이트로프루사이드(sodium nitropress side)와 같은 외인성 일산화질소원에 대한 평활근 링의 반응성을 다시 결정합니다.

이러한 방식의 접근법은 혈관의 100% 이완 값을 결정하며, 혈관 이완에 대한 산화질소 반응을 매개하는 가용성 구아닐릴 사이클레이스의 필수적인 성격을 보여줍니다. ODQ는 아세틸콜린에 반응하여 소듐 니트로프루사이드에 의해 일어나는 이완을 방해하기 때문에, 건강한 대조군 마우스의 대동맥 링은 이완된 반면, 내피 기능 장애가 있는 마우스의 대동맥 링은 산화질소 생성 감소로 인해 이완이 감소된 것을 나타냈습니다. 또한 대조군 동물들을 대상으로 아질산염의 화학발광을 이용한 그룹별 탈질화 분석이 수행되었습니다.

환원적 탈질소화 분석법(reductive denitros assay)을 사용하여 RSNO와 RNNO를 검출하였습니다. 피크 면적을 차감함으로써 아질산염(nitrite)과 r sno 수준을 측정하였습니다. 이 방법은 순환하는 이러한 일산화질소 대사물질의 수준이 조직 수준을 어떻게 반영하는지, 그리고 서로 다른 질환 상태에서 질환 대사물질이 어떻게 변하는지와 같이 일산화질소 및 혈관 생물학 분야의 핵심 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다.

단일 동물의 여러 장기 시스템과 전신 순환계에서 이러한 관련 일산화질소 대사산물의 정상 상태 농도와 반감기를 결정하면, 질병 과정의 특정 분자적 시그니처를 식별할 수 있으며, 새로운 일산화질소 기반 치료법을 정의하는 데 도움이 되어 임상의가 질병의 중증도나 진행 정도를 판단할 수 있는 더 나은 바이오마커를 확보할 수 있게 될 것입니다. 일반적으로 일산화질소 분야의 입문자들은 생물학적 샘플에서 발견되는 이러한 낮은 수준의 일산화질소 대사산물을 검출하고 정량화하기에 많은 분석법의 민감도가 충분하지 않기 때문에 어려움을 겪을 수 있습니다. 무엇보다도, 숙련되지 않은 작업자는 샘플 처리 과정에서 아티팩트를 생성할 가능성이 높으며, 이는 잘못된 데이터 생성과 데이터의 오해석으로 이어질 수 있습니다.