Monocytes과 인간 혈액의 작은 샘플에서 돌기 세포의 리니지 특정 수신자 같은 수용체 - 매개 시그널링의 정량 이미징

다음 실험의 전반적인 목적은 이미지 스트림 기술를 사용하여 명확하게 정의된 환자 코호트 유래 일차 면역 세포의 세포 메커니즘을 정량화하는 것을 시연하는 것입니다. 이는 먼저 환자 또는 건강한 자원봉사자로부터 얻은 혈액 샘플에서 말초혈액 단핵구 또는 pbmc를 분리함으로써 수행됩니다. 분리 후, 세포를 활성화하고 형광 표지를 합니다.

다음으로, 세포를 유체역학적으로 집중시키고 레이저 광으로 여기시킨 후 시간 지연 통합(time delay integration) CCD 카메라로 이미징합니다. 마지막으로, 이미지 스트림 사이토미터를 사용하여 이미지를 획득하고 NF kappa b를 정량화합니다.

각 세포 이미지의 전위(Translocation) 분석은 ideas 소프트웨어를 사용하여 수행합니다. 최종적으로, 도트 플롯(dot plot), 히스토그램 및 세포 이미지 분석을 통해 각 피험자 그룹 간의 차이를 결정할 수 있습니다. 이미지스트림(ImageStream)의 장점은 FACS 데이터와 면역형광법을 결합한다는 점입니다.

우리는 단일 세포 또는 세포 집단 수준에서 소량의 혈액 샘플만으로 계통 특이적인 방식으로 세포 신호 전달 경로를 살펴볼 수 있습니다. 이 방법은 신호 전달 중간체를 국소화하고 정량화함으로써 지식의 핵심적인 질문들에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 예를 들어, 전사 인자의 핵 내 이동을 매개하는 작용을 조사하거나 세포 생물학에 미치는 노화의 영향을 살펴보는 데 사용할 수 있습니다.

본 실험실의 연구원이 지원자로부터 얻은 말초혈액 단핵구를 분리한 후 해당 기술을 시연하겠습니다. 회수된 p BMC를 배지 0.6 mL당 3 × 10⁶ 개의 세포 농도로 재현탁한 후, 세포 현탁액을 1.5 mL 튜브로 옮깁니다. 그다음, 일부 세포를 여기 보이는 TLR8 작용제인 R848과 같은 활성제로 자극하고, 모든 세포를 5% CO₂ 배양기에서 37 °C로 10분에서 60분 동안 배양합니다.

배양 기간 후, 상온에서 500 ×g로 5분 동안 원심분리하여 세포를 펠렛화하고 상층액을 제거합니다. 단핵구 또는 DC 계열에 특이적인 표면 항체 칵테일로 4°C에서 20분 동안 세포를 라벨링하며, 이때 보정 대조군으로 사용할 단일 색상 접합체로 라벨링된 세포 튜브를 포함합니다. 그다음 상온에서 4% PFA PBS로 10분 동안 세포를 고정합니다. 상온에서 500 ×g로 10분 동안 세포를 원심분리한 후, PBMC를 냉동 버퍼에 재현탁하고 분석 당일까지 -80°C에서 보관합니다.

37 °C 항온수조에서 세포를 빠르게 해동한 후, 원심분리하여 동결 보존액을 제거하고 100 µL의 BD perm wash buffer로 투과화합니다. 그 다음, 여기에 표시된 anti NF kappa BP 65 항체와 같은 세포 내 신호 전달 성분 항체를 이용하여 상온에서 20분 동안 표지합니다. 세포를 펠렛으로 모은 후, goat anti rabbit IgG가 포함된 100 µL의 BD perm wash buffer에 재현탁합니다.

Alexa 647을 처리하고 PBMC를 실온에서 20분 더 배양합니다. 이미징 직전에 핵 염색약으로 세포를 대조 염색합니다. 먼저 ImageStream의 전원을 켜고 Inspire 소프트웨어를 실행합니다. 그다음 'load default template'을 클릭하고 'initialize fluidics'를 선택합니다.

그런 다음 이미지 갤러리 메뉴를 클릭하고 '전체 선택'을 누릅니다. 이제 '설정 실행'을 눌러 비드 이미징을 시작하고 명시야 채널을 선택합니다. 스피드 비드가 작동하기 시작하면, 보조 탭 아래의 '모두 시작'을 클릭하여 기기를 보정하고 테스트합니다.

ImageStream 시스템 보정이 완료되면, flush, lock and load를 눌러 가장 밝은 시료를 장비에 로드합니다. 그 다음, 도트 플롯(dot plot)에서 측정된 각 flora chrome의 최대 픽셀 값이 104,000 counts 사이가 되도록 레이저 출력을 설정하십시오. 그런 다음 세포 분류 기준을 설정합니다.

이제 실행(run)을 클릭하고 획득(acquire)하여 실험 데이터 파일을 수집 및 저장합니다. 데이터 파일을 분석하려면 먼저 분석 소프트웨어인 ideas를 엽니다. 보정된 이미지 파일을 생성한 다음, 정상적인 핵 염색 강도와 높은 핵 염색 종횡비를 가진 이벤트에 게이트를 설정합니다. R1 게이트 내의 단일 세포를 부스러기(debris) 또는 다세포 이벤트와 구별하기 위해, CD14 양성 세포 게이트 내에서 단핵구를 찾으며, CD11c가 높고 CD4 및 lin1 마커가 낮은 골수성 수지상 세포는 R3 게이트에 위치합니다.

마지막으로, ideas 소프트웨어를 사용하여 세포질 전사 인자인 NF kappa B와 핵 염색약의 공국소화를 결정합니다. NF kappa B와 핵 염색약의 높은 상관관계는 두 마커의 공국소화를 나타내며, 이는 높은 유사도 점수로 반영되어 세포의 활성화 정도를 나타냅니다. 서로 다른 처리군 또는 환자 집단 간의 높은 유사도 이벤트 비율을 비교하여 세포의 상대적인 기능적 효율성을 평가할 수 있습니다.

그 후 소프트웨어를 사용하여 모집단 히스토그램의 주요 세그먼트에서 세포 이미지를 표시할 수 있습니다. ImageStream을 사용하면 pbmc에서 세포 하위 집합을 직접 게이팅할 수 있으며, 게이팅되었으나 분리되지 않은 세포 모집단의 세포 반응을 이미지화할 수 있습니다. 여기서는 기저 상태에서 lin one 음성, CD four dim, CD 11 C 양성 골수성 dcs 내 NF kappa BP 65의 핵 국소화에 미치는 TLR 신호 전달의 효과를 정량화하였습니다.

자극을 주지 않은 세포의 상당수에서 전사 인자인 NF kappa BP 65가 세포질에 존재하는 것이 관찰되었습니다. 자극 후, 처리된 세포에서 NF Kappa BP 65와 핵 염색제인 PI의 유사성 점수가 유의미하게 높게 나타났으며, 이는 자극 후 NF Kappa BP 65가 핵 내로 전위되었음을 나타냅니다. 처리하지 않은 세포군과 R 8 48로 자극한 세포군에서 동시에 수집한 디지털 이미지는 대표적인 세포들과 세포핵 내로 전위된 NF kappa B의 강도를 보여줍니다. 처리하지 않은 세포와 비교하여 R 8 48 자극 그룹에서 NF Kappa B와 PI 염색 강도가 더 밝게 나타남에 주목하십시오.

당사는 다양한 연령대의 공여체로부터 유래한 세포에 이 기술을 적용하여 TLR 매개 NF kappa B 활성화 경로의 차이를 확인하였습니다. 숙달된 후에는 이미지 분석에 소요되는 추가 시간을 제외하고 하루 만에 이 기술을 수행할 수 있어, 여러 장의 국소화 이미지와 집단 통계치를 모두 얻을 수 있습니다. 또한, 물리적 분리 없이 여러 세포 집단으로부터의 반응을 직접 이미지화할 수 있습니다. Image stream은 다양한 세포 메커니즘에 광범위하게 적용될 수 있으며, 중개 연구에서 매우 가치 있게 활용될 것입니다.