세 가지 차원 혼합 셀 회전 타원체 공동 문화에서 Mammary 상피 세포의 분리

본 절차의 전체적인 목적은 3차원 혼합 세포 조직 배양으로부터 상피 세포를 유도하여, 기질 섬유아세포가 상피 세포 생물학에 미치는 영향을 분석하는 것입니다. 이는 먼저 3차원 혼합 세포 스테로이드 공배양을 구축함으로써 달성됩니다. 그 후, 공배양 후의 상피 세포를 분리하기 위해 매트릭스 배양에서 구형체(spheroids)를 분리합니다.

다음 단계는 공동 배양 후의 상피 세포를 분석 준비가 될 때까지 계대 배양하는 것입니다. 최종적으로, 3차원 배양에서 섬유아세포에 노출되었을 때 상피 세포의 행동에 미치는 영향은 배양물의 현미경 이미징과 공동 배양 후 분석을 통해 평가할 수 있습니다. 상피 세포의 경우, 여기에서 보여주는 매트릭스 침습의 형광 이미징 및 Transwell 이동 분석 등이 있습니다. 공동 배양을 구축한 다음 날, 저희 실험실의 연구원인 Quin이 해당 절차를 시연하겠습니다.

냉동고에서 matrigel을 꺼내 4°C 냉장고 내 얼음 위에서 하룻밤 동안 해동합니다. 실험 당일에는 matrigel과 혼합하기 최소 한 시간 전에 배양액을 얼음 위에 둡니다. 해동된 matrigel을 희석합니다.

공동 배양에 필요한 양의 절반에 해당하는 차가운 H Mac 배지를 얼음 위에 놓인 멸균 튜브에 넣습니다. 그 다음, 튜브를 얼음 위에 둔 상태로 해동된 matrigel을 동일한 부피만큼 추가하여 1:1 희석액을 만듭니다. 이어서, 24웰 플레이트의 지정된 웰 중앙에 matrigel 배지 혼합물 50 µL를 넣고, 습윤 공기와 5% CO2가 공급되는 37 °C 인큐베이터에서 10분 동안 배양합니다.

그런 다음 웰에 matrigel 배지 혼합물을 450 µL 더 추가하고 60분 동안 더 배양합니다. 두 번째 배양 단계 동안, H me 배지 0.5 mL당 0.5 × 10⁵ cells 농도로 섬유아세포와 상피세포의 1:1 현탁액을 준비합니다. matrigel 배지 혼합물이 응고되면 세포 현탁액을 겔 상단에 조심스럽게 떨어뜨리고 배양기를 사용하여 이틀 동안 배양합니다.

2~3일마다 웰의 측면에서 배지를 매우 조심스럽게 흡입하여 제거하고 신선한 HEC 배지로 부드럽게 교체하십시오. 현미경으로 매일 스페로이드 형성을 관찰하고, 필요에 따라 광학 또는 형광 현미경을 사용하여 이미지를 촬영하십시오. 멸균된 2 mL 유리 피펫을 사용하여 배양물을 10회나 상하로 피펫팅하여 시작합니다. 그런 다음 유리 피펫으로 배양물을 멸균된 15 mL 원심분리 튜브로 옮기고 실온에서 350 ×g로 10분 동안 원심분리합니다. 원심분리가 완료되면 세포 스페로이드가 튜브 바닥에 가라앉게 됩니다.

멸균된 파스퇴르 피펫 팁을 사용하여 원심분리기 상단에서 분해된 매트리젤을 조심스럽게 제거하십시오. 준비 단계입니다. 이제 펠렛 형태의 스테로이드에 H mac 배지 1 mL를 첨가하고, 멸균된 2 mL 유리 피펫으로 2~3회 위아래로 섞은 후, 배양물을 24-웰 조직 배양 플레이트의 웰로 옮기십시오. 배지를 교체하기 전, 스테로이드가 플레이트에 부착될 수 있도록 최소 48시간 동안 유지하십시오.

시간이 지남에 따라 세포들은 구형 구조를 벗어나 단층으로 성장하게 됩니다. 세포 배양이 50% Confluence에 도달하면 표준 프로토콜을 사용하여 35 millimeter 디쉬로 계대 배양하여 2~4일 동안 배양하고, 세포의 추가 분석 전 100 millimeter 디쉬로 계대 배양하여 3~5일 동안 배양합니다. 멸균된 pasture pipette을 사용하여 배지를 흡입한 후, 남아 있는 ghost spheroids를 가능한 한 수동으로 제거합니다. 3차원 spheroid 공배양에서 그림 D, E, F에 제시된 것과 같이 TM one silencing이 설계된 섬유아세포는 그림 A, B, C의 대조군 섬유아세포와 비교하여 유선 상피세포의 매트릭스 침습을 증가시킵니다. 그림 D와 F의 화살표로 표시된 것처럼 TM one silenced 섬유아세포가 포함된 spheroid에서 매트릭스로 침습하는 상피 돌기에 주목하십시오. 여기 그림 J, K, L에 제시된 TM one의 과발현이 설계된 섬유아세포는 그림 G, H, I의 대조군 섬유아세포와 비교하여 유방암 세포주 sum 1 59의 침습을 감소시켰습니다. 공배양 spheroid가 형성되면, 그림 G와 I의 화살표로 표시된 대조군 섬유아세포 포함 spheroid와 TM one engineered 섬유아세포 포함 spheroid에서 상피 돌기가 나타나지 않는 것을 비교하십시오.

세포 집단은 2차원 환경에서 재배양함으로써 스테로이드로부터 분리할 수 있습니다. 이 합성 이미지는 matrigel 배양에서 분리한 후 광학 및 형광 현미경으로 관찰한 배양 세포의 모습을 보여줍니다. 0일째는 분리 직후의 이미징을 나타내며, 1일, 2일, 5일째는 분리 후 경과된 일수를 나타냅니다.

이 스테로이드에서 빠져나오는 세포들의 코로나(corona)가 시간이 지남에 따라 증가하는지 확인하십시오. 결국, 화살표로 강조 표시된 것과 같이 세포가 거의 남아 있지 않은 고스트 스테로이드(ghost steroid) 상태가 됩니다. 고스트 제거 및 계대 배양 후에는 스테로이드가 거의 남지 않습니다.

테스트된 세포들의 상대적 성장 속도에 따라 결과가 달라질 수 있습니다. 순수 집단은 연속 계대를 통해 나타나거나 적절한 세포 마커를 사용하여 분리할 수 있습니다. 본 예시에서는 유세포 분석기를 사용하여 샘플을 분석하며, 녹색 형광과 적색 형광을 이용하여 각각 GFP 발현 섬유아세포와 mCherry 발현 상피세포를 식별함으로써 상피세포와 섬유아세포의 상대적 집단 비율을 결정합니다.

3D 공배양으로부터 분리한 후에도 상피세포는 섬유아세포와의 장기간 공배양을 통해 부여된 특성을 유지하므로, 분석을 위한 충분한 기회를 가질 수 있습니다. 본 예시에서는, TM one 결핍 섬유아세포에 노출된 공배양 H max가 대조군 섬유아세포(여기서는 C로 표시)에 노출된 경우와 비교하여, 3D 공배양에서 분리된 후 수 주 동안 증가된 이동성을 유지했음을 보여줍니다. 이 절차에 이어 유전자 발현 및 후성유전적 표지의 변화를 분석하는 것과 같은 다른 방법들을 수행하여, 섬유아세포가 상피세포에 미치는 영향에 관한 추가적인 질문에 답할 수 있습니다.